阿尔茨海默病患者血清GGT、CTHRC1表达水平检测及临床意义

陈俊，郑锦豪，陈家良，陈博

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是痴呆症的最常见的类型，截至2016年全球患病例数达4 700万，且其发病率有不断升高的趋势［1］。AD的具体发病机制尚不清楚，通常认为与细胞外淀粉样斑块沉积、氧化应激及炎症反应等有关。虽然近年来磁共振成像等影像技术能对沉积的β淀粉样肽（amyloid-beta protein，Aβ）和tau蛋白进行分子成像，有助于AD的早期诊断及疗效评估，但价格昂贵，临床难以普及［2］。因此，寻找具有较高特异性的AD血清标志物具有重要的临床意义。γ-谷氨酰转移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）是一种I型γ-谷氨酰转移酶，可催化谷胱甘肽的谷氨酰部分转移至多种氨基酸和二肽受体，参与神经递质代谢、一氧化氮信号传导和氧化应激等过程的调节［3］。氧化应激损伤是AD发病的重要影响因素，GGT在AD疾病发生、发展过程中发挥重要的作用，有望成为一种新的生物标志物［4］。胶原蛋白三螺旋重复蛋白1（collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）基因位于8号染色体，分子质量为30 ku，其作为一种分泌型蛋白，广泛参与形态发生、血管重塑等病理、生理过程［5］。近年来有研究利用高通量蛋白质质谱分析发现，CTHRC1在AD患者脑脊液中表达显著升高，可能是早期诊断AD新的标志物［6］。本研究旨在通过检测AD患者血清GGT和CTHRC1表达水平，探讨两者的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020年1月—2022年1月于湖北省中医院脑病科及浙江省中医药研究院中医内科住院部诊治的120例AD患者为研究对象（AD组），AD诊断标准符合中国医师协会2018年制定的《中国痴呆与认知功能障碍诊治指南》。男70例，女50例，年龄62～84岁，平均（74.08±7.19）岁；体质量指数（BMI）平均（22.43±2.04）kg/m2；病程1～6年，平均（1.79±0.52）年；受教育年限平均（6.81±2.65）年；高血压史45例；糖尿病史33例；吸烟史（＞20包/年）34例。排除标准：合并恶性肿瘤、精神障碍性疾病等；伴颅脑外伤或脑卒中等疾病引起的认知功能损害；伴有急性感染性疾病、骨代谢性疾病等；合并肝炎、肝硬化等肝胆系统疾病。选取同期于湖北省中医院体检者60例为对照组，男33例，女27例，年龄63~82岁，平均（73.51±6.46）岁；BMI平均（22.01±2.15）kg/m2；受教育年限平均（7.01±2.79）年；高血压史18例；糖尿病史15例；吸烟史19例；均无脑卒中、帕金森病、AD等疾病病史。2组性别（χ2=0.182）、年龄（t=0.518）、BMI（t=1.279）、受教育年限（t=0.469）、高血压史（χ2=0.989）、糖尿病史（χ2=0.128）及吸烟史（χ2=0.214）差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准通过（伦理号：M201908011），患者家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 观察指标 收集所有研究对象的性别、年龄、BMI、吸烟史、高血压史、糖尿病史及受教育年限等一般资料。收集AD组患者入组后第1天和对照组健康查体时实验室检查指标包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

1.2.2 血清GGT、CTHRC1及炎性因子水平检测 所有研究对象于清晨空腹采集静脉血5 mL，3 000 r/min离心5 min，取上层血清待测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清GGT、CTHRC1及炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6水平。GGT ELISA试剂盒购自上海齐泰生物公司（货号QT13290），CTHRC1 ELISA试剂盒购自上海瑞番生物公司（货号RF1214），TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技公司。采用免疫比浊法检测血清超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平，实验步骤严格按照实际和说明书进行。

1.2.3 认知功能评估 2组均采用简易智能精神状态检查量表（mini-mental state examination，MMSE）评估认知功能障碍程度［7］，评估内容包括记忆、定向、计算、注意、语言和视空间各项能力，总评分范围0～30分，得分越低，患者认知功能障碍程度越严重。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用表示，2组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例或例（%）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关。受试者工作特征（ROC）曲线分析血清GGT、CTHRC1单独及联合检测对AD的诊断价值。利用R语言3.6.3版本中Delong检验比较各指标诊断AD的诊断效能差异。多因素Logistic回归分析影响AD发生的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组血脂和胆固醇水平比较 2组TC、TG、HDL-C及LDL-C差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 2组患者血清GGT、CTHRC1、炎性因子及MMSE评分比较 与对照组比较，AD组血清GGT、CTHRC1、TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP水平升高，而MMSE评分降低（均P＜0.05），见表2。

Tab.1 Comparison of blood lipid and cholesterol levels between the two groups表1 2组血脂和胆固醇水平比较（mmol/L）

Tab.1 Comparison of blood lipid and cholesterol levels between the two groups表1 2组血脂和胆固醇水平比较（mmol/L）

均P＞0.05。

组别对照组AD组t或χ2 n 60 120 TC 3.93±0.41 4.05±0.46 1.709 TG 1.42±0.31 1.46±0.30 0.834 HDL-C 0.98±0.15 1.01±0.17 1.159 LDL-C 2.73±0.36 2.81±0.38 1.355

Tab.2 Comparison of serum levels of GGT,CTHRC1 and inflammatory factors between the two groups of patients表2各组血清GGT，CTHRC1及炎症因子水平比较

Tab.2 Comparison of serum levels of GGT,CTHRC1 and inflammatory factors between the two groups of patients表2各组血清GGT，CTHRC1及炎症因子水平比较

＊＊P＜0.01。

组别对照组AD组t n 60 120 GGT（U/L）23.87±6.09 47.14±7.92 19.985＊＊CTHRC1（μg/L）32.73±5.64 43.27±6.42 10.800＊＊TNF-α（ng/L）147.35±13.12 196.27±12.42 24.446＊＊组别对照组AD组t IL-6（ng/L）61.34±11.54 106.34±13.27 22.370＊＊IL-1β（ng/L）28.29±6.28 38.34±7.14 9.256＊＊hs-CRP（ng/L）1.91±0.73 5.08±0.62 30.446＊＊MMSE评分（分）28.34±1.04 15.66±3.22 29.702＊＊

2.3 AD患者血清GGT、CTHRC1表达与炎症因子、MMSE评分的相关性 AD组患者血清GGT、CTHRC1表达与TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP水平呈正相关，与MMSE评分呈负相关（均P＜0.05），见表3。

Tab.3 Correlation of serum GGT and CTHRC1 expression with inflammatory factors and MMSE score in the AD group表3 AD组血清GGT、CTHRC1表达与炎症因子、MMSE评分的相关性 （r）

2.4 影响AD发生的多因素Logistic回归分析 以是否发生AD（是=1，否=0）为因变量，以TNF-α、IL-6、IL-1β、hs-CRP、GGT、CTHRC1及MMSE评分为自变量，Logistic回归分析显示，较高水平GGT、CTHRC1是影响AD发生的独立危险因素，而较高MMSE评分是影响AD发生的保护因素（P＜0.05），见表4。

2.5 血清GGT和CTHRC1单独及联合检测对AD的诊断价值 血清GGT、CTHRC1联合检测概率方程为：Log（P/1-P）=-1.754+0.251×GGT+0.298×CTHRC1。两者联合诊断效能优于GGT或CTHRC1单一指标（Z分别为4.370和5.657，P＜0.05），见表5、图1。

Tab.4 Multivariate Logistic regression analysis on the occurrence of AD表4 影响AD发生的多因素Logistic回归分析

Tab.5 Diagnostic value of serum GGT and CTHRC1 alone and in combination for AD表5血清GGT，CTHRC1单独及联合检测对AD的诊断价值

Fig.1 ROC curve analysis of the diagnostic value of serum GGT,CTHRC1 alone and combined detection in AD图1 ROC曲线分析血清GGT，CTHRC1单独及联合检测对AD的诊断价值

3 讨论

AD是一种中枢神经系统退行性疾病。遗传代谢研究表明，Aβ肽的积累是AD发生、发展过程中的早期事件，Aβ肽能够诱导组织细胞产生大量活性氧，造成氧化和抗氧化系统平衡失调，大量活性氧在造成神经细胞膜、蛋白及DNA损伤的同时还能激活机体免疫细胞，释放TNF-α、IL-6及IL-1β等大量促炎细胞因子，引起严重的神经炎症反应［8］。神经元氧化应激损伤可导致患者认知功能障碍、记忆力下降，当疾病进展时可出现较严重的神经精神症状，最终导致患者死亡［9］。因此，深入研究AD发生、发展机制，寻找影响氧化应激过程的关键分子标志物，有助于AD早期诊治。

GGT是细胞内一种促氧化应激的因子，是氧化应激的重要标志物，参与细胞内抗氧化因子谷胱甘肽摄取和其细胞外的分解代谢过程［10］。近年来研究发现，外周血中活性氧水平升高会导致神经元细胞死亡和损伤，且其水平升高与血管性痴呆等神经系统疾病关系密切［11］。本研究结果显示，AD患者血清GGT水平较体检健康者升高，并且与炎性因子TNFα、IL-6、IL-1β及hs-CRP呈正相关，提示GGT可能通过促进炎性因子的表达，促进AD的疾病进展，考虑可能原因为GGT能够降解细胞外谷胱甘肽，导致机体氧化和抗氧化系统平衡失调，产生过量TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子，最终导致神经细胞的氧化应激和炎症损伤［12］。此外，有研究发现，GGT表达水平升高可通过影响铁蛋白的表达，导致脑内铁超载，促进AD患者疾病进展［13］。本研究中，AD患者血清GGT水平与MMSE评分呈负相关，提示血清GGT水平有助于反映AD患者认知障碍的程度，考虑原因可能为GGT的表达升高引起氧自由基的积累，导致大脑中的脂质过氧化和神经元变性，进而加重AD的疾病严重程度［14］。此外，GGT水平升高还可导致血管内皮细胞损伤，促进血管动脉粥样硬化斑块的形成，加重AD患者认知障碍损伤程度［4，15］。进一步研究发现，GGT水平升高是影响AD发生的独立危险因素，证实了血清GGT可能是一种新的AD血清标志物，其可通过促进炎性细胞因子分泌，加重AD患者认知功能损伤。

CTHRC1是一种细胞外分泌糖蛋白，参与血管重塑、骨形成、炎症性关节炎和癌症进展等多种生理和病理过程［16］。AD的发生与神经元线粒体损伤及能量转换缺陷关系密切，神经元可以将受损的线粒体转移到星形胶质细胞进行处理和回收，受损的线粒体产生损伤相关标志物并释放到脑脊液中。CTHRC1作为一种线粒体损伤的标志物，可能参与AD的发生、发展过程［6］。在5XFAD转基因小鼠AD模型中研究证实，线粒体功能障碍可导致Aβ肽血管沉积，从而形成淀粉样血管病变，导致线粒体损伤蛋白CTHRC1能够通过血脑屏障释放到外周血［6］。本研究显示，AD患者血清CTHRC1表达较健康体检者明显升高，提示CTHRC1可能参与AD的发生。有研究发现，AD患者脑组织CTHRC1的表达与Aβ的表达呈正相关，CTHRC1可通过促进细胞外淀粉样斑块沉积，促进AD进展［17］。本研究进一步分析发现，血清CTHRC1表达与炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β及hs-CRP呈正相关，与MMSE评分呈负相关，表明CTHRC1表达升高可能通过加重AD患者炎症反应，促进AD患者认知功能损伤。有研究表明，CTHRC1表达上调能够激活经典和非经典的Wnt信号通路，促进β-连环蛋白的表达，β-连环蛋白能够直接促进TNF-α等促炎细胞因子的表达，加重组织炎症反应［18-19］。此外，有研究显示，CTHRC1能够通过激活单核巨噬细胞等免疫细胞，诱导免疫细胞分泌促炎细胞因子IL-6、IL-1β、CRP并促进组织基质金属蛋白酶产生，导致组织炎症性损伤［20］。目前，临床上对AD的诊断主要根据临床表现及神经心理量表，但早期诊断的敏感性和特异性不高。本研究中，血清GGT和CTHRC1联合检测对AD发生具有较高的诊断价值，临床医师可根据血清GGT和CTHRC1水平对AD疾病进行早期诊断及治疗，以提高AD患者的生活质量，改善临床预后。

综上所述，GGT、CTHRC1可能通过调控炎症反应，从而参与AD发生、发展，加重AD患者认知功能损伤，血清GGT、CTHRC1表达升高是影响AD发生的独立危险因素，两者联合检测对AD具有较高的诊断价值，但本研究样本量有限，未对AD患者治疗过程中血清动态变化进行监测，有待今后扩大样本量进行深入研究。