Notch信号通路在活动性类风湿关节炎中的作用①

程增玉 徐浩东 唐晓颇 （中国中医科学院广安门医院，北京100053）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是常见的慢性致残性自身免疫性疾病，我国大陆地区的患病率为0.42%［1］。关节是RA主要受累器官，其高度骨破坏引发的致残问题十分严峻［2］。滑膜样成纤维细胞增殖与迁移，巨噬细胞释放炎症因子、血管新生、骨破坏等病理改变，诱发并加重RA关节症状。研究发现，Notch信号通路在活动性RA的各项病理环节中均发挥重要作用。

Notch信号早在1917年就已被发现，因其功能部分缺失会在果蝇翅膀边缘造成切迹而得名，迨至1983年，ARTAVANIS教授等［3］成功分离出Notch基因，在近1个世纪的研究中，科学家发现Notch信号实际上是细胞间的通信系统，在调控细胞增殖、维持、分化和凋亡方面发挥重要作用。作为高度保守的信号通路，Notch在细胞表面广泛存在，在免疫系统的发育和功能中起着基础作用，并在RA中扮演重要角色［4］。本文结合近20年研究进展，阐述Notch信号通路在活动性RA中的作用。

1 Notch信号通路的组成及激活

1.1 Notch的组成 Notch信号通路的组成主要包括受体、配体、转录因子，其他效应因子和调节因子，其中调节因子γ分泌酶、去整合素和金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM），在Notch信号通路的不同活化阶段中起关键作用［5］。

Notch受体、配体均为Ⅰ型跨膜蛋白，哺乳动物体内存在4种高度同源的Notch受体，即Notch1～4。其同源配体分属2类，分别是Delta-like（DLL）1、3、4和Jagged1、2［4，6］。在其他物种中，Notch配体存在差异，如在果蝇中为Delta、Serrate两类蛋白，在线虫中为Lag-2蛋白，故Notch配体又简称为DSL蛋白。

转录因子位于细胞核中，是DNA连接蛋白，在不同的物种中转录因子有不同的称谓和构成，如哺乳动物为CBF1，果蝇为Su（H），线虫为Lag-1，故在Notch信号中，三者统称为CSL转录因子［7］。

1.2 Notch信号的激活 Notch受体属于单次跨膜蛋白，结构可分为胞外域、跨膜区和胞内域（Notch intracellular domain，NICD），大多数情况下，Notch信号由邻近细胞上表达的跨膜配体所激活［8］。简而言之，胞外域的主要功能是实现Notch受体与配体的结合，启动信号，胞内区的主要功能是将信号传导至细胞核，实现信息传递。Notch信号的激活有两种途径，其中经典途径为［8-10］：一个细胞（信号发送细胞）上的膜系Notch配体与相邻细胞上的跨膜Notch受体相互作用，Notch受体是由跨膜亚基和胞外亚单位组成的异源二聚体，当其与相邻细胞的跨膜配体结合后，受体亚基分离，跨膜亚单位发生蛋白水解性裂解，最初的切割由ADAM10或ADAM17介导，使Notch胞外域脱落。最后的切割由γ-分泌酶完成，介导并释放NICD。释放后的NICD进入细胞核，与CSL转录因子以及共激活因子，一起参与核心转录复合物，从而激活靶基因的转录。Hes和Hrt两大家族即是Notch信号传导的重要靶基因［11］。而非经典的Notch信号激活途径则可以由非经典配体启动，或在没有配体的情况下启动，或不需要切割Notch受体［8，12］。

2 Notch信号通路在RA中的作用概述

2.1 Notch信号与RA成纤维样滑膜细胞的关系成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是RA滑膜增生和侵袭的主要效应细胞。特定的FLS以及高度专业化的细胞和细胞外基质的相互作用使滑膜具有独特性，正常的FLS在健康关节腔内发挥维持和重塑关节腔的功能，而在RA中，FLS有助于局部产生细胞因子、小分子炎症介质和降解细胞外基质的蛋白水解酶，使炎症持续存在，并逐步导致关节软骨破坏［13-14］。FLS能够调节组织稳态，协调炎症反应，是RA中慢性炎症的重要介质［15］。FLS的扩张和增殖是RA滑膜炎的一个动态成分，研究表明FLS的增殖与RA 28个关节的疾病活动性评分（DAS28）、病程呈正相关［16］。FLS的重要作用日益受到关注，逐渐成为RA治疗的靶细胞。

尽管FLS分化和增殖的分子机制尚不明确，但目前研究证实，Notch信号通路在其中发挥重要作用［17］。WEI等［18］使用单细胞RNA测序技术，发现Notch3信号驱动FLS的转录，参与其浓度梯度的改变，认为Notch3信号在FLS分化中占有一席之地。此研究观察到在活动性RA中，Notch3和Notch靶基因在FLS中显著上调，敲除实验动物Notch3基因，或阻断其信号传导，可减轻关节炎症反应，并预防关节损伤。研究发现FLS与内皮来源的Notch信号调节存在一致性，此种基质串扰通路构成关节炎的病理基础［18］。2021年，CHEN等［19］研究人员构建胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠，利用免疫组织学方法在RA滑膜组织中检测Notch1和Notch3胞内域和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α），旨在全面了解缺氧诱导的FLS通过Notch1和Notch3信号转导的分子机制，评估其作为治疗靶标的潜力。研究发现Notch1胞内域（Notch 1 intracellular domain，N1ICD），N3ICD和HIF-1α在RA滑膜组织中大量表达。缺氧条件下HIF-1α可以直接调节Notch1和Notch3基因表达，N1ICD和N3ICD抑制剂LY411575对CIA大鼠具有治疗作用，此研究确定了HIF-1α与Notch1、Notch3信号在调节FLS活化和RA中的功能联系。RA滑膜增厚与FLS有关，FLS的密集与否，是由内皮细胞（endothelial cell，EC）表达的Notch配体驱动和维持，相关配体激活了FLS表面的Notch3，进而促进FLS增殖，经Notch3阻断的单克隆抗体处理过的RA小鼠FLS减少了Notch介导的基因表达，减轻关节炎和骨质侵蚀的严重程度，提示两者之间的紧密关系［20］。

一些早期报道也证实了Notch通路参与RA滑膜炎的病理过程，XU等［21］表明Notch1信号通路参与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α诱导的RA滑膜细胞增殖。ANDO等［22］发现RA滑膜细胞核显示出Notch1和Notch4抗体的强烈染色，并证实TNF诱导FLS中Notch1、Notch4和Jagged-2表达。JIAO等［17］将FLS暴露于TNF-α（10 ng/ml）环境，发现Notch信号转导的靶基因Hes-1增加，Notch2、DLL1、DLL3 mRNA水平显著上调，予γ-分泌酶抑制剂（DAPT）阻断Notch信号传导，可抑制FLS分泌IL-6，而使用Notch配体DLL1的重组融合蛋白处理可促进这种反应。此项研究显示，以不同的干预方式调控Notch信号通路，能够起到抑炎和促炎的作用，提示Notch通路参与RA关节炎的病理过程。

上述研究从RA滑膜细胞入手，主要探究了Notch信号通路与FLS的关系，FLS是RA滑膜炎重要的参与者，Notch信号与FLS的密切关系，使之成为研究热点。

2.2 Notch信号与RA巨噬细胞的关系 RA作为慢性炎症性自身免疫病，其发病机制在很大程度上是通过增加促炎细胞因子的产生来介导的，这些细胞因子反过来又激活了局部的炎症环境，进一步将免疫介质聚集到组织中。巨噬细胞是髓样的免疫细胞，其策略性地分布在全身，吞噬并降解凋亡细胞、病原体等，参与并协调炎症过程。根据其广谱分化状态下表型，巨噬细胞可分为两个极端子集：经典激活（M1）促炎细胞和可选激活（M2）抗炎细胞，二者虽在功能上相去甚远，但在一定条件下可相互转化。

巨噬细胞作为滑膜炎的中心效应细胞，表现出高度活化的表型，并产生全套促炎细胞因子、趋化因子和生长因子，M1巨噬细胞因通过释放各种类型的促炎细胞因子，如TNF、IL-6，IL-1，导致疾病发生或加重，而备受关注［23-24］。巨噬细胞高度活化，使滑膜炎持续存在［14］。研究发现在炎症状态下伴有Notch信号活化、巨噬细胞极化以及炎症因子的释放，Notch信号被激活时，能明显促进巨噬细胞释放炎症介质［25］。

RA的症状和体征会随着促炎细胞因子的增加而加剧，而与之相反的抗炎细胞因子，会缓解RA的症状和体征［26］。以上多项研究结果发现RA滑膜细胞存在TNF诱导RA FLS中Notch1、Notch4和Jagge2，提示Notch信号转导参与了TNF-α诱导的RA滑膜细胞增殖。

骨髓源性炎症巨噬细胞中的Notch信号是RA滑膜炎症的关键，代表着有希望的未来治疗靶点［27］。在TNF-转基因（transgenic，Tg）小鼠的滑膜中，Notch信号传导的细胞数量显著增加，其中约60%是炎症M1巨噬细胞，予以Notch抑制剂，可降低TNF诱导的M1，增加小鼠M2数量，减少关节损伤。因此，在TNF-Tg小鼠的发炎滑膜中具有活化的Notch信号传导的主要细胞是源自骨髓细胞的M1，提示它们可代表炎症关节炎患者的新治疗方法［28］。

巨噬细胞的极化状态从M1转向M2，以终止炎症反应，促进组织损伤后修复，对活动性RA的缓解有重要作用。上述研究表明Notch信号通路参与此过程，有专家认为可以将Notch信号视为针对感染和炎症驱动疾病的潜在治疗靶标［29］。采用γ分泌酶抑制剂DAPT治疗感染的巨噬细胞，使巨噬细胞极化向M2抗炎表型反应转移，此项研究结果证明了Notch信号在感染过程中对巨噬细胞反应起关键作用，也为活动性RA的治疗提供新思路［30］。

2.3 Notch与RA血管翳的关系 RA滑膜炎早期变化的特征是血管生成、炎症细胞浸润和滑膜细胞增生。血管生成和细胞迁移在炎症性疾病的发病机制中起重要作用，尤其是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是这一过程的主要调节者，过度的血管生成对促进和维持RA的病情活动起正向作用［31］。

既往研究表明，滑膜血管生成先于RA的所有其他病理特征［31-32］。RA患者的VEGF水平高于骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者，VEGF对RA关节炎的持续存在，以及滑膜血管扩张、关节破坏均起重要作用［33］。Notch1介导VEGF/血管生成素（Angiopoietin，Ang）2诱导的炎症关节炎血管生成和EC侵袭。GAO等［34］通过体外研究发现，单独或联合使用VEGF和Ang2可显著诱导Notch1、DLL4 mRNA表达。使用Notch1 siRNA或DAPT，可抑制VEGF/Ang2诱导的EC侵袭、血管生成和迁移，提示Notch与血管生成有密切关系。同时，EC的活化可促进细胞迁移，增加黏附分子和趋化因子表达，反过来再次加重RA滑膜炎症状［23］。

缺氧也是血管新生的条件之一。使用质谱的代谢谱分析检测，研究人员发现RA-FLS的糖酵解增加，而HIF-1α是糖酵解的诱导者，其在RA-FLS中的表达不仅与滑膜迁延和侵袭有关，还能与Notch信号相关作用，诱导血管翳的新生［35-36］。研究表明，Notch-1/HIF-1α共同介导了缺氧诱导的炎症关节炎中的血管生成和侵袭［37］。此外，Notch3也是病理性血管形成的关键调节因子，在缺氧条件下，Notch3与HIF-1α协同调节Ang2表达和新生血管形成［38］。

DLL4作为Notch信号通路中的一种重要配体，具有EC特异性，能够在生理及病理血管生成中特异表达［39］。DLL4-Notch信号在血管发育中发挥关键作用，哺乳动物胚胎单个DLL4等位基因的缺失，可导致功能性血管系统无法形成而不良发育［40］。使用DAPT不仅能直接抑制病理细胞中Notch信号通路，还能干扰病理细胞与血管上皮细胞之间Notch信号转导，有效改善RA血管翳生成［6，41］。

病理性新生血管在RA滑膜炎中起重要作用，有专家提出阻断血管生成，对RA有相当大的治疗效益，而Notch信号与RA新生血管形成有密切联系，可作为相应的靶点［33，42］。

2.4 Notch信号与骨破坏 破骨细胞是一种吸收骨骼的细胞，成骨细胞与破骨细胞二者的平衡，在骨骼代谢中发挥重要的作用。Notch信号传导不仅调控免疫系统反应，同时还参与破骨细胞的分化。因此，在免疫系统与骨骼系统交叉连接的条件下，Notch信号通路有希望成为治疗靶标［43］。

既往研究强调了Notch信号在生理和TNF介导的炎症性骨重塑中的功能［44］。Notch信号通路对正常骨骼重塑至关重要，ZHANG等［45］研究人员分离RA小鼠间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC），并对其进行RNA测序，以探究成骨细胞分化降低的机制，结果发现RA小鼠的MSC中存在53条信号通路失调，其中编码Notch信号和NF-κB通路的基因表达明显升高。研究者进一步向RA小鼠使用Notch抑制剂，发现Notch信号阻断，可防止骨质流失减少和成骨细胞抑制，而MSC中持续的Notch活化，则可减少RA相关的成骨细胞分化，该研究表明Notch抑制剂可以预防炎症介导的骨质破坏与流失。SEKINE等［46］探究Notch受体和配体，何者在破骨细胞形成中发挥关键作用，结果显示Notch2/DLL1和Notch1/Jagged1轴对破骨细胞的差异调节可能是改善RA患者骨侵蚀的新靶标。此研究为特异性地抑制Notch信号提供参考，也为Notch信号抑制剂的开发提供思路。

3 小结与展望

Notch信号是进化相对保守的通路，在一个世纪的探索中，人们对Notch信号的组成、激活、传导、抑制等都有了整体的认识。在胚胎发育、肿瘤、内分泌、循环、免疫等多领域疾病中的广泛作用日渐受到关注，以调节Notch信号传导为中心的治疗策略已受到重视和应用。滑膜炎、骨破坏是活动性RA临床治疗的重点和难点，其病理过程的复杂性，要求科研人员寻找新靶点，实现精准治疗。Notch信号在活动性RA中发挥重要作用，许多病理反应可归因于Notch通路过激活。遗憾的是，中医、中药在治疗活动性RA、抑制Notch信号通路方面的研究并不多，发挥中医复方优势，研究常用中药药理，弥补此方面的不足，对活动性RA治疗，以及Notch信号的深入探索有重要意义。