TCF3在结直肠癌中高表达并促进结直肠癌转移

陈夕浪，冯维博，陈 捷，夏丽敏，吴开春

(1空军军医大学西京医院消化内科，肿瘤生物学国家重点实验室，国家消化系疾病临床研究中心，陕西 西安 710032；2华中科技大学同济医学院同济医院消化内科，肝脏胃肠病研究所，肝胆胰疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430030)

结直肠癌是世界范围内造成癌症相关死亡的第三大常见原因，每年约有185万结直肠癌新发病例和85万结直肠癌相关死亡病例[1]。结直肠癌是一种高转移性肿瘤，约有20%的患者在初诊时就已存在远处转移，其中肺转移占10%～15%。转移性结直肠癌恶性程度极高，在不接受治疗的情况下，患者中位生存时间仅为9个月，5年生存率仅为3%[2]。因此，探索结直肠癌转移的相关分子机制有助于开发新型治疗药物，以改善患者临床预后。

T细胞因子3(T cell factor 3，TCF3)是T细胞因子/淋巴增强子因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)转录因子家族成员，TCF/LEF其他家族成员还包括TCF7、LEF1和TCF4[3]。TCF/LEF转录因子与Wnt/β-catenin信号通路关系密切，经典Wnt信号通路活化后会促进β-catenin进入细胞核与TCF/LEF家族转录因子形成复合物，进而转录调控一系列靶基因的表达并参与肿瘤的发生与发展[4]。近年来，TCF3在人类肿瘤进展中的重要作用逐渐被阐明。JIA等[5]发现TCF3转录激活FAM201A后通过miR-186-5p上调TNKS1BP1的表达，进而促进三阴性乳腺癌增殖和转移。TCF3通过激活LINC00152/miR-1182/CDK14轴促进骨肉瘤增殖和转移[6]。此外还有研究报道TCF3与ASBEL共同下调活化转录因子3的表达进而促进结肠癌的形成和增殖[7]。

在结肠癌患者中，Wnt通路相关基因存在高频突变。据统计，约有94%的结直肠癌患者至少存在1种Wnt/β-catenin信号通路中所含基因的突变[8]。失调的Wnt信号通路进而通过调节c-MYC、cyclinD1、Msi1等靶基因的表达，参与结直肠癌的转移、侵袭、增殖和分化[9]。而TCF3作为Wnt/β-catenin信号通路下游的一种关键效应分子，可能在结肠癌进展中发挥重要作用，然而对其在结肠癌中的表达和功能知之甚少，有待进一步明确。本研究联合生物信息学和免疫组化手段明确了TCF3在结直肠癌中的表达情况及预后意义，并通过慢病毒转染实验、Transwell实验和尾静脉注射肺转移实验探索了TCF3在结直肠癌转移侵袭中的作用，旨在初步明确TCF3在结直肠癌中的表达和功能，以期为结直肠癌治疗新策略的发展提供相关科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人结直肠癌细胞(SW480、DLD-1、Caco-2、HT29、SW620、LoVo)保存于实验室液氮中。胎牛血清、DMEM培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；兔抗TCF3单克隆抗体(ab69999)购自Abcam公司，鼠抗β-actin抗体(#3700)购自CST公司，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZB-2301)购自中杉金桥公司；RIPA裂解液、结晶紫溶液、BCA定量试剂盒、青霉素-链霉素溶液、嘌呤霉素购自碧云天公司；Transwell小室、基质胶购自Corning公司；小鼠SP试剂盒(SP9002)、兔SP试剂盒(SP9001)购自北京中杉金桥公司；TCF3过表达和敲减病毒购自上海吉凯公司；人结肠癌组织芯片购自上海芯超公司；6～8周龄BALB/c裸鼠购自北京维通利华公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学探索结直肠癌中TCF3表达情况 使用UALCAN网站分析TCF3在结直肠癌和正常组织中的表达差异。此外，本研究还使用TNMplot网站分析TCF3在结直肠癌组织和配对癌旁组织的表达情况。为探究TCF3在结直肠癌中的基因特征，本研究使用RosettaSX网站进行分析。

1.2.2 免疫组织化学检测临床样本中TCF3表达水平

结肠癌组织芯片提前置入65 ℃烘箱烤片90 min。按照标准流程将切片脱蜡、水化，使用PBS洗涤后放入柠檬酸钠修复液中高压修复2 min，自然冷却至室温，PBS洗涤后放入曲拉通溶液10 min，随后切片滴加30 mL/L H2O2溶液后，置于避光湿盒中封闭10 min。PBS洗涤后使用山羊血清室温封闭30 min，滴加兔抗TCF3 IgG抗体(1∶500)，置于4 ℃冰箱过夜；滴加山羊抗兔IgG(1∶200)，室温孵育30 min；PBS洗涤3次，每次持续3 min。随后使用辣根酶标记的卵白素孵育15 min。使用DAB溶液染色3～5 min，后在流水下冲洗10 min，苏木素染色20 s，再次置于流水下冲洗。最后，切片经脱水、透明后封片。切片的染色结果由2名对随访结局不知情的病理医师独立进行评分。染色强度为0～3分(0分为不着色，1分为着色浅，2分为着色适中，3分为着色深)，染色面积为0～4分(0分为阴性，1分表示1%≤面积<25%，2分表示25%≤面积<50%，3分表示50%≤面积<75%，4分表示75%≤面积≤100%)。免疫组化总评分为二者乘积，评分≤3分为阴性，≥4分为阳性。

1.2.3 细胞培养及病毒转染 所有结直肠癌细胞系均使用含100 mL/L胎牛血清，100 U/mL青霉素-链霉素培养基培养，细胞置于温度为37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培养。采用慢病毒转染技术构建TCF3过表达、敲减细胞。取对数生长期的细胞混于DMEM培养基制备成细胞悬液铺于六孔板，摇匀后置于孵箱中培养，细胞贴壁生长至贴合度为30%～40%后，在含10 mg/L聚凝胺的无血清培养基中按照说明书推荐量加入慢病毒，随后替换六孔板中原有培养基，转染16 h后，培养基换为完全培养基，继续培养24 h后，使用浓度为2.5 mg/L的嘌呤霉素筛选2周获得稳定转染细胞株。

1.2.4 蛋白提取及Western blotting 取对数生长期细胞，消化离心后制备成细胞悬液，均匀铺于六孔板中，细胞汇合度为80%～90%时，弃去培养基，PBS轻涮2遍，每孔加入适量细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)，冰上裂解15 min，收集裂解液并转移至1.5 mL EP管，随后超声裂解，4 ℃离心，收集上清液，将上清液与上样缓冲液4∶1混合后，于100 ℃加热10 min。所得蛋白样品置于-20 ℃保存。使用10% SDS-PAGE分离所得蛋白样品，半干转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，100 g/L的脱脂牛奶封闭条带1 h，条带分别转移相应一抗中置于4 ℃冰箱过夜。条带经TBST洗涤3次后，与对应二抗室温孵育1 h后，经TBST洗涤3次，采用发光液发光显影，得到蛋白相对表达情况。

1.2.5 Transwell探索TCF3对结直肠癌细胞转移、侵袭能力的影响 迁移实验步骤：消化、离心处于对数生长期的结直肠癌细胞，使用适量无血清DMEM培养基重悬细胞，小室上室内加入200 μL细胞悬液，向下室中加入600 μL 200 mL/L FBS培养基，随后放入孵箱中培养。培养48 h后，取出小室，使用PBS涮洗3遍，使用多聚甲醛固定10 min，随后置于浓度为5 g/L的结晶紫染液中染色10 min。PBS涮洗小室3遍，并用湿棉签轻轻擦拭上室中的细胞，小室晾干后显微镜拍照分析。进行侵袭实验前，待基质胶置于4 ℃液化后，使用无血清培养基按6∶1的比例将基质胶稀释，每个小室加50 μL基质胶并涂抹均匀，于37 ℃放置4 h，其余步骤与迁移实验完全一致。

1.2.6 尾静脉注射肺转移实验 每组含10只6～8周龄雄性BALB/c裸鼠，使用耳标标记。培养扩增带荧光素酶标记的稳定转染细胞系，消化、离心细胞后，使用PBS重悬制备成密度为5×109个/L的悬液，随后经裸鼠尾静脉注射200 μL细胞悬液。注射当日记为第0周，每周都对裸鼠生物学发光进行活体成像分析，监测肺脏转移情况，密切记录小鼠存活情况，第9周时集中处死小鼠，收集其肺脏进行HE染色。

2 结果

2.1 生物信息学分析显示TCF3在结直肠癌中高表达

UALCAN网站分析结果显示，与正常结肠、直肠组织相比，TCF3 mRNA表达量在结肠癌、直肠癌中显著升高(P<0.01，图1A)。研究组通过TNMplot网站分析结直肠癌和其配对的癌旁组织TCF3的mRNA表达水平，发现同癌旁组织相比，结直肠癌中TCF3的mRNA表达水平明显上调(P<0.01，图1B)。RosettaSX网站分析结果显示结直肠癌患者中TCF3的mRNA表达量与患者的不良预后显著正相关(P<0.01，图1C)。以上结果共同表明，TCF3在结直肠癌患者中显著上调，并且可能与结直肠癌进展相关。

A：UALCAN数据库中TCF3在结肠癌组织(n=286)及正常组织(n=41)，直肠癌组织(n=166)及正常组织(n=10)中的mRNA表达情况；B：TNMplot网站分析TCF3在结直肠癌组织及其配对正常组织中的mRNA表达情况；C：RosettaSX网站分析结直肠癌中TCF3表达情况与结直肠癌患者不良预后的相关性。 bP<0.01。

2.2 TCF3在结直肠癌样本中显著上调并提示预后不良

研究组为进一步验证TCF3在肿瘤组织和正常组织间的表达差异，对结直肠癌组织芯片进行免疫组化染色，发现TCF3在癌组织和癌旁组织中均有表达，主要位于细胞核(图2A)。并且与正常组织相比，癌组织中TCF3表达量显著升高(P<0.05，图2B)。为探究TCF3是否具有预后意义，研究组根据组化染色所得评分，将结直肠癌患者分成TCF3阳性组和TCF3阴性组，并且结合患者随访信息进行生存分析。与TCF3阴性组患者相比，TCF3阳性组总体生存时间明显缩短(P<0.01，图2C)，复发率明显升高(P<0.01，图2D)。这些结果表明，TCF3在结直肠癌患者中显著上调，并且与患者不良预后有关。

A：结肠癌组织和癌旁组织中TCF3典型免疫组化染色图像；低倍镜图像标尺为100 μm，高倍镜图像标尺为20 μm；B：69对结直肠癌组织和癌旁组织TCF3免疫组化染色评分， aP<0.05；C：TCF3不同表达水平与总体生存时间的关系， bP<0.01 vs TCF3阴性；D：TCF3不同表达水平与复发率的关系， bP<0.01 vs TCF3阴性。

2.3 TCF3在结直肠癌中与上皮间质转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和肿瘤干性相关

为探究TCF3在结直肠癌中的作用，研究组通过RosettaSX网站分析发现TCF3在结直肠癌中与EMT、肿瘤干性显著相关(P<0.01，图3)。而此前研究证实EMT、肿瘤干性与肿瘤的侵袭、转移密切相关[10-11]，所以我们推测TCF3具有促进结直肠癌转移的作用。

图3 RosettaSX网站分析TCF3表达水平与结直肠癌EMT和肿瘤干性的相关性

2.4 TCF3促进结直肠癌细胞体外迁移和侵袭

研究组首先对结直肠癌细胞系的TCF3表达水平进行检测，Western blotting结果显示高侵袭结直肠癌细胞系(LoVo，SW620)中TCF3水平显著高于低侵袭结直肠癌细胞系(SW480，DLD-1，Caco-2；图4A)。随后挑选SW480细胞进行慢病毒转染构建TCF3高表达的细胞株，使用LoVo细胞构建TCF3敲减细胞株(图4B)。并进一步通过Transwell实验发现，在SW480细胞中上调TCF3能显著促进SW480体外迁移和侵袭，而下调TCF3表达能显著抑制LoVo细胞迁移和侵袭能力(P<0.01，图4C～D)。研究组通过以上结果发现TCF3具有促进结直肠癌细胞体外迁移、侵袭的能力。

2.5 TCF3促进结直肠癌细胞肺转移

随后研究组构建了裸鼠尾静脉注射肺转移模型探究TCF3在体内是否能促进结直肠癌细胞远处转移。动物实验结果显示，TCF3基因表达上调能显著增加裸鼠肺脏荧光信号增长速率(P<0.05，图5A～B)，提高结直肠癌肺脏转移发生率，增加肺脏转移灶的数量(P<0.01，图5C～D)。更为重要的是，TCF3基因的上调显著缩短了该组小鼠的总体生存时间(P<0.05，图5E)。TCF3基因的下调效应与之相反，注射TCF3敲减LoVo细胞组的小鼠肺脏转移率、肺脏结节数目、肺脏荧光信号增长速率均低于对照组，并使小鼠生存获益(图5A～D, F)。以上结果表明TCF3表达量上调能促进结直肠癌细胞肺转移。

A：Western blotting检测TCF3在不同结直肠癌细胞系中的表达水平；B：Western blotting检测TCF3过表达、敲减后TCF3蛋白的表达情况；C：Transwell探索转染病毒后对SW480、LoVo细胞体外迁移、侵袭能力的影响，标尺为200 μm；D：SW480、LoVo细胞侵袭、迁移能力半定量分析， bP<0.01。NC：过表达阴性对照组；OE：TCF3过表达组；shNC：敲减阴性对照组；KD：TCF3敲减组。

A：尾静脉注射后第9周，各组代表性活体成像图像；B：尾静脉注射后0～9周，各组荧光信号强度增长速率， aP<0.05 vs SW480-NC， cP<0.05 vs LoVo-KD；C：各组小鼠肺脏转移结节数目统计图， aP<0.05， bP<0.01；D：各组代表性肺脏HE染色图像，低倍镜标尺为1 mm，高倍镜标尺为100 μm；E：注射SW480细胞组小鼠总生存时间， aP<0.05 vs SW480-NC；F：注射LoVo细胞组小鼠总生存时间， aP<0.05 vs LoVo-KD。NC：过表达阴性对照组；OE：TCF3过表达组；shNC：敲减阴性对照组；KD：TCF3敲减组。

3 讨论

远处转移是造成结直肠癌相关死亡的重要原因之一，肺脏是结直肠癌常见的远处转移器官[12]。深入探究结直肠癌转移的分子机制，有助于开发新的治疗策略，改善转移性结直肠癌患者预后。Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌的发生发展中起着重要作用。据统计，高达90%的结直肠癌患者发生能使Wnt/β-catenin信号通路持续激活的基因突变[13]，而这些基因的突变最终将导致β-catenin核内积累[9]。β-catenin是该通路的关键效应分子，它的功能状态和其细胞定位有关，当β-catenin位于细胞核内时，常常发挥转录调控和染色质互作的作用[14]，并且结肠癌细胞核内β-catenin高表达水平多提示患者预后不良[15]。β-catenin转运到核内后与TCF/LEF形成转录复合物，调控下游靶基因的表达，在发生肿瘤时转录复合物活性出现失调，使得下游基因转录增强，细胞间黏附减弱，最终导致肿瘤迁移和侵袭[16-18]。可见TCF/LEF家族与肿瘤的进展密切相关。

TCF/LEF家族是Wnt/β-catenin通路下游重要的效应分子，其与β-catenin结合形成转录复合物，共同参与激活下游基因的进程。多篇研究报道TCF/LEF家族在肿瘤的发生和进展中发挥了重要作用。例如LEF1和TCF1在鼻咽癌组织中的表达量较正常组织显著上升，LEF1表达水平也与鼻咽癌淋巴结转移、高级别分期、不良预后显著正相关，并且LEF1能作为鼻咽癌预后不良的独立危险因素[19]。过表达LEF1能逆转由miR-621上调所造成的结肠癌肝转移的抑制状态[20]。LEF1在不依赖雄激素型前列腺癌细胞LNCaP-AI中显著高表达，LEF1敲减后前列腺癌细胞的增殖和侵袭能力显著下降[21]。TCF4通过调控CCL2/CCR2的表达，促进肿瘤相关巨噬细胞的募集和M2型巨噬细胞的极化来促进结直肠癌肝转移[22]。由此可见，TCF/LEF家族在肿瘤的转移进程中发挥至关重要的作用。

而TCF3作为TCF/LEF家族成员，其在多种肿瘤中处于异常高表达状态并和肿瘤的发生、发展密不可分。在乳腺癌中，TCF3与乳腺癌的低分化状态、成瘤、增殖特性相关[23]。在前列腺癌组织中，TCF3表达量显著升高并能促进前列腺癌细胞的增殖和对阿霉素耐药[24]。TCF3增强胶质瘤增殖和转移能力，且能抑制胶质瘤细胞的凋亡[25]。近期有研究报道，TCF3在肝癌组织中显著高表达，与肿瘤大小、TNM分期正相关，可作为判断肝癌患者预后的独立危险因素，体外实验证实TCF3通过调控Wnt信号通路促进肝癌细胞增殖[26]。然而TCF3在结直肠癌的研究报道较少，TCF3在结直肠癌中的表达情况及功能有待研究。为初步探索TCF3在结直肠癌中的表达情况，本研究首先通过分析公共数据库数据初步证实相较于正常结肠组织，TCF3在结直肠癌中显著高表达，并提示不良预后，随后通过免疫组化检测结直肠癌组织中TCF3蛋白的表达水平，研究组发现癌组织中的TCF3蛋白表达量显著高于正常组织，并且TCF3阳性组患者的预后要显著差于TCF3阴性组，体现在阳性组患者总体生存时间缩短，术后复发率显著升高。此前研究的结论与之相似，该研究发现TCF3在复发型结直肠癌中高表达，其表达与结直肠癌组织学类型、无疾病生存期相关，并且可以作为预后的独立预测因素[27]。接下来研究组通过分析公共数据库发现，TCF3在结直肠癌中与EMT和肿瘤干性显著正相关，此前研究证实EMT和肿瘤干性均与肿瘤的转移密切相关。为验证TCF3在结直肠癌的转移中是否发挥作用，研究组首先通过Western blotting检测不同结肠癌细胞系中TCF3蛋白表达量，发现结肠癌高侵袭能力细胞系中TCF3显著高表达，而在低侵袭细胞系中TCF3呈低表达趋势，随后研究组构建了TCF3过表达和敲减细胞株，并通过Transwell实验探索TCF3在结直肠癌转移中的潜在作用，Transwell结果显示TCF3过表达能显著促进结直肠癌细胞体外迁移和侵袭能力，体内实验结果也同样证实TCF3上调能促进结直肠癌细胞肺转移。

综上所述，本研究通过综合生物信息学分析手段和实验验证证实了TCF3在结直肠癌中高表达，并且促进结直肠癌肺转移。近年来靶向Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂越来越多，部分抑制剂已进入临床试验阶段，动物实验结果显示靶向TCF/β-catenin的新型抑制剂治疗结直肠癌甚有疗效[28]。本研究初步明确了TCF3在结直肠癌中的表达情况及功能，进一步巩固了靶向TCF/LEF治疗结直肠癌的理论基础，指出TCF3是能够预测结直肠癌患者预后的生物标志物及有效的治疗靶点。然而，本研究存在一定局限性，TCF3通过何种机制调控结直肠侵袭、转移能力仍不清楚。后续课题组将进一步完善TCF3促进结直肠癌转移的理论基础，为靶向TCF3治疗结直肠癌提供更为充分的科学依据。