+15 Gz重复暴露状态小鼠骨髓间充质干细胞转录组分析

王亚珍，傅昭粤，沈娱汀，李 娟，侯永利，马千里，方 亮，陈丽华

(空军军医大学基础医学院免疫学教研室，陕西 西安 710032)

高性能飞机在执行飞行任务时往往会产生反复出现的正加速度(positive acceleration，+Gz)，使飞行员处于+Gz重复暴露状态[1]，长期的+Gz暴露会对飞行员的心血管系统、神经系统和骨骼肌肉系统产生影响，使飞行员面临因心脑功能损伤、脊柱损伤、颈椎腰椎和骨关节退行性变所导致的永久性飞行任务限制[2-7]，严重威胁飞行员的健康和职业生涯。为提高飞行员对+Gz的耐受能力，减轻+Gz重复暴露对飞行员所造成的损伤，科学家们进行了大量研究。如有研究表明，适当的+Gz重复暴露训练可显著增加飞行员的心血管功能储备，提高其对+Gz的抗荷能力[8]；同时，也有研究表明，低+Gz预适应可显著减轻高+Gz重复暴露导致的脑皮质和神经元的损伤，改善高+Gz暴露引起的学习记忆功能障碍[9]；适当时间和强度的+Gz暴露可促使骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨细胞分化增殖，促进机体的成骨[10-11]；+Gz促进BMSCs表达多种参与成骨分化相关基因，如ALPL、RUNX2和BMP2等，促进BMSCs向成骨细胞分化[12]；但关于+Gz影响BMSCs整体转录组状态的研究并不多见。鉴于此，本研究将在+15 Gz重复暴露状态下的小鼠作为研究对象，探索不同暴露时间小鼠BMSCs的整体转录组变化情况，并初步分析成骨分化相关基因的表达变化情况。本研究为进一步探索高+Gz影响BMSCs成骨的机制研究打下基础，也为适当+Gz暴露训练增强成骨、改善机体对压力负荷的承受能力提供一定的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

20只6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，饲养条件为SPF级，平均体质量为20 g，购自空军军医大学实验动物中心。将小鼠随机分为4组：①+15 Gz暴露1周组(+15 Gz，15 min/d，连续离心1周)；② 1周对照组(0 Gz，15 min/d，连续处理1周)；③+15 Gz暴露3周组(+15 Gz,15 min/d，连续离心3周)；④ 3周对照组(0 Gz，15 min/d，连续处理3周)，每组5只。其中，在+15 Gz暴露1周组和1周对照组的小鼠中随机选取3只小鼠、+15 Gz暴露3周组和3周对照组中随机选取2只小鼠提取BMSCs用于转录组测序。本实验经空军军医大学实验动物福利与伦理委员会审批通过(许可证号：20180101)。

1.2 方法

1.2.1 +Gz暴露 通过小鼠固定装置将C57BL/6小鼠固定在动物离心机旋转短臂上，头朝向离心机轴心，使小鼠身体长轴与离心加速度保持平行。+Gz暴露组小鼠接受+15 Gz暴露15 min/d，分别持续暴露1周和3周。两对照组小鼠只用装置固定15 min/d，分别持续1周和3周，不进行+Gz暴露。各组暴露周期完成24 h后，进行后续实验。

1.2.2 BMSCs的提取与鉴定 45 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，采用颈椎脱臼法处死小鼠。750 mL/L乙醇浸泡消毒小鼠5 min后，于超净工作台中剥离小鼠的股骨和胫骨，剪开关节面，注射器吸取PBS冲出骨髓，并使用70 μm滤网过滤以制备单细胞悬液。之后进行细胞计数，按1×106个细胞/孔的密度接种于六孔板。使用含100 mL/L胎牛血清的低糖DMEM培养基培养细胞(37 ℃、50 ml/L CO2细胞孵箱)，待融合至80%～90%时进行传代。通过流式细胞术检测培养至第二代的BMSCs表面标志物的表达情况。所用流式抗体为APC标记的抗小鼠CD45抗体(157606，Biolegend，美国)、FITC标记的抗小鼠CD90抗体(105305，Biolegend，美国)和PE标记的抗小鼠CD105抗体(120407，Biolegend，美国)。以三种荧光的Isotype抗体(981806，400605，400508；Biolegend，美国)作为对照。根据细胞量加入相应体积的抗体，4 ℃避光孵育30 min。流式清洗液洗两次后，再加入200 μL流式清洗液重悬。通过流式细胞仪检测CD45、CD90和CD105的表达情况来鉴定提取的细胞是否为BMSCs。

1.2.3 转录组测序结果分析 将提纯培养的各组小鼠BMSCs弃去培养上清，PBS洗两次后，加入Trizol(1 mL/孔)裂解细胞并提取总RNA。使用Agilent 2200生物分析仪对RNA进行定性和定量。将标记的cDNA文库按等比汇集在一起，在Illumina HiSeq X Ten系统的单通道中进行150 bp的对端测序。HTSeq法测定基因和lncRNA计数，RPKM法测定基因表达。对mRNA进行显著性分析、P值计算和伪发现率(false discovery rate，FDR)分析后，采用DESeq算法对差异表达基因进行筛选，筛选标准为：①|log2(差异倍数)|>0.585；②FDR<0.05。

1.2.4 成骨分化相关基因表达变化分析 以生物学过程作为依据将差异基因进行GO富集分析，并分析DESeq算法所筛选出的差异表达基因，得到有关成骨分化生物学过程的4个差异基因(Alpl、Runx2、Spp1和Bmp2)。分析4个差异基因表达水平在各组的变化情况。

1.2.5 成骨分化相关差异基因表达的RT-qPCR验证

用Trizol法提取各组小鼠BMSCs的总RNA，按照Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒说明书反转录为cDNA。以GAPDH作为内参基因，采用CFX96 real-time PCR检测系统和SYBRPremixExTaqTMⅡ检测mRNA的表达水平，采用Ct(2-ΔΔCt)计算样本间mRNA的相对表达量。PCR引物序列见表1。

表1 基因引物序列

2 结果

2.1 小鼠BMSCs的分离培养与鉴定

在两组小鼠完成+15 Gz暴露24 h后，提取小鼠的BMSCs，通过流式细胞术鉴定CD45-CD90+CD105+的BMSCs。BMSCs的鉴定结果如图所示，细胞表达CD45阴性(图1A)、CD90和CD105阳性(图1B～C)，确定分离培养的细胞为BMSCs。

A：所提取BMSCs上CD45的表达情况；B：所提取BMSCs上CD90的表达情况；C：所提取BMSCs上CD105的表达情况。BMSCs：骨髓间充质干细胞；Isotype：同型对照。

2.2 +15 Gz暴露小鼠BMSCs差异基因的筛选及聚类分析

为明确+15 Gz重复暴露对小鼠BMSCs的影响，我们对4组转录组数据进行分析，筛选+15 Gz重复暴露后小鼠BMSCs中差异表达的基因。结果显示，与1周对照组小鼠相比，+15 Gz重复暴露1周小鼠BMSCs上调的基因有42个，下调的基因有207个(图2A～B)；+15 Gz重复暴露3周小鼠相较于3周对照组BMSCs有127个上调的基因和16个下调的基因(图2C～D)。

A：+15 Gz暴露1周小鼠的差异基因热图；B:+15 Gz暴露1周小鼠的差异基因火山图；C：+15 Gz暴露3周小鼠的差异基因热图；D:+15 Gz暴露3周小鼠的差异基因火山图。FDR：伪发现率。

2.3 +15 Gz暴露小鼠BMSCs差异基因的GO富集分析

为明确+15 Gz重复暴露具体通过哪些生物学过程影响小鼠BMSCs的功能，对筛选出的差异基因进行了GO富集分析。结果显示，与1周对照组小鼠相比，+15 Gz重复暴露1周小鼠BMSCs上调的基因主要富集在蛋白质翻译和磷酸化水平负性调节的生物学过程中(图3A)，而+15 Gz重复暴露3周小鼠相较于3周对照组BMSCs上调的基因主要富集在细胞黏附和成骨分化生物学过程中(图3B)。以上结果证明，+15 Gz重复暴露3周能有效促进小鼠BMSCs的成骨分化，而+15 Gz重复暴露1周组尚不能促进成骨分化。

A：+15 Gz暴露1周小鼠的GO富集分析；B：+15 Gz暴露3周小鼠的GO富集分析。

2.4 +15 Gz暴露小鼠BMSCs差异基因的KEGG通路富集分析

为确定+15 Gz暴露影响小鼠BMSCs功能的可能信号通路，本研究对转录组数据进行了KEGG通路富集分析，按照富集分数的大小，筛选出了+15 Gz暴露组富集的前15个信号通路。KEGG通路富集分析结果显示，与对照组相比，+15 Gz重复暴露1周组上调的基因主要富集在细胞黏附分子、ErbB和Ras信号通路(图4A)，而暴露3周小鼠BMSCs上调的基因主要富集在基质与胞外受体相互作用、黏着斑、PI3K/Akt、cGMP-PKG和Wnt信号通路(图4B)。提示+15 Gz暴露可能通过以上这些信号通路影响小鼠BMSCs的功能，也为研究相关分子机制提供一定的数据参考。

A：+15 Gz暴露1周小鼠的KEGG通路富集分析；B：+15 Gz暴露3周小鼠的KEGG通路富集分析。

2.5 +15 Gz暴露小鼠BMSCs成骨分化相关基因表达情况

为进一步探索+15 Gz对小鼠BMSCs向成骨细胞分化的影响，我们从筛选出的基因中挑选出了与成骨分化相关的基因，以其差异倍数作为纵坐标，观察+15 Gz暴露组与其对照组相比这些基因的表达变化情况。结果显示，与1周对照组相比，+15 Gz暴露1周小鼠BMSCs成骨相关差异基因Alpl的表达明显增加，约为1周对照组的1.6倍(图5A)，Runx2、Spp1和Bmp2的表达则无明显变化；而+15 Gz暴露3周组小鼠BMSCsAlpl的表达增加，约为3周对照组的3.43倍(图5B)，Runx2、Spp1和Bmp2的表达亦无明显差异。接着我们用RT-qRCR验证了各组差异基因mRNA的表达变化情况，结果显示，+15 Gz暴露1周小鼠BMSCs成骨相关差异基因Alpl和Bmp2转录水平有增加趋势，但无显著差异；而+15 Gz暴露3周小鼠BMSCs成骨相关差异基因Alpl转录水平显著上升(P<0.01)，提示+15 Gz重复暴露3周可能通过增加Alpl的表达促进BMSCs的成骨分化。

A：+15 Gz暴露1周相对于1周对照组小鼠BMSCs转录组成骨相关差异基因；B：+15 Gz暴露3周相对于3周对照组小鼠BMSCs转录组成骨相关差异基因；C：RT-qRCR检测+15 Gz暴露1周组和1周对照组小鼠BMSCs成骨相关差异基因mRNA表达水平(n=3)；D：RT-qRCR检测+15 Gz暴露3周组和3周对照组小鼠BMSCs成骨相关差异基因mRNA表达水平(n=3， bP<0.01)。

3 讨论

由于职业因素宇航员与飞行员经常暴露于+Gz环境中，如载人火箭发射时，宇航员暴露于+3.2 Gz中；当载人航天器关闭第一个发动机后，宇航员将暴露在+3.6～+4.0 Gz中达30 s；喷气式战斗机的飞行员可能会反复经历+9 Gz暴露[13]。为探索+Gz暴露对宇航员和飞行员身体健康的影响并找到预防或缓解的方式，LEE等[13]创建新的公式用来预测与人类暴露+Gz强度对应小鼠的重力负荷来构建小鼠+Gz暴露模型，结果显示，小鼠的+9 Gz暴露强度接近于人类的+2.7 Gz强度。既往研究证实小鼠对+Gz的耐受能力远超人类，半数致死量为20 G[14]。有研究表明，+15 Gz暴露属于小鼠生理耐受范围内[15]，且大于+9 Gz，更接近于宇航员所经历的暴露强度，因此我们选择建立+15 Gz暴露小鼠模型来探索+Gz暴露对BMSCs成骨的影响。

尽管+Gz重复暴露作为飞行员面临的环境因素，通常给飞行员的身体健康带来负面影响，然而近年来有许多研究发现，适当强度和时间的+Gz重复暴露与其他训练方式结合的方法能通过增加心血管功能储备，增强飞行员对+Gz的抗荷能力。短臂人体离心机的应用也为间歇性人工重力训练及相关研究提供了便利[16-17]。除此之外，大量研究表明，+Gz可作为一种正向的调控因素应用于骨再生领域，如有研究发现，+20 Gz暴露可协同骨诱导性纳米颗粒增强BMSCs向成骨细胞分化，改善成骨[10]；+12 Gz的暴露可通过增加成骨细胞分化关键基因Runx2、成骨相关基因骨钙素和维生素D受体的表达，预防长期卧床患者的废用性骨萎缩[18]；+3 Gz暴露通过小鼠的前庭系统提高了肌肉中卵泡抑素的水平，卵泡抑素可拮抗激活素A对BMP诱导的间充质细胞分化为成骨细胞的抑制作用[19]。然而关于+Gz影响BMSCs转录组的整体分析并不多见。

在本研究中，我们对小鼠进行不同时间的+15 Gz暴露，然后再提取小鼠的BMSCs进行转录组测序，并通过差异基因的KEGG通路富集分析确定了+Gz影响BMSCs生物学功能的几条信号通路，包括PI3K/Akt、cGMP-PKG和Wnt信号通路等。既往研究表明，巨噬细胞MSR1通过激活PI3K/Akt/GSK3β/β-连环蛋白途径促进BMSCs成骨分化和M2型巨噬细胞分化[20]；BMSCs分泌的细胞外囊泡所包含的miR-22-3p可能导致MYC/PI3K/Akt通路的抑制，从而通过FTO抑制促进成骨分化[21]；具有半胱天冬酶募集结构域的细胞凋亡抑制因子通过激活Fgf-2/PI3K/Akt信号促进BMSCs的增殖和成骨分化[22]。这些结果增加了本研究中KEGG通路富集分析提示的PI3K/Akt为+Gz暴露调节BMSCs成骨分化相关分子机制的可信度。除此之外，有研究表明，内源性心房利钠肽和NO/cGMP/PKG-Iα信号通路在调节BMSCs存活和增殖中扮演着不可或缺的作用[23]；间充质干细胞来源的外泌体miR-19b抑制WWP1或Smurf2的表达，并通过Wnt/β-catenin信号通路提高KLF5的表达，从而促进骨折愈合[24]；Foxf1敲低通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨，并防止卵巢切除术诱导的骨质流失[25]。这些研究也从侧面验证了cGMP/PKG和Wnt信号通路参与+Gz影响BMSCs生物学功能的可能性。

本研究发现，+Gz重复暴露1周和3周均能显著增加小鼠BMSCs成骨分化相关基因Alpl的转录水平。有研究发现，Alpl功能丧失或突变可能引起细胞内Ca2+内流减少，人和小鼠BMSCs的成骨分化下调，导致骨质疏松[26]；甲基乙二醛，是一种源自糖酵解途径的活性羰基代谢物，可降低参与成骨分化基因Runx2和Alpl的表达，对BMSCs来源成骨细胞的胶原代谢和分化产生负面影响[27]。因此，Alpl可能是参与+Gz重复暴露调控小鼠BMSCs成骨分化的关键基因之一。

综上所述，本研究通过对+15 Gz重复暴露1周和3周小鼠的BMSCs进行转录组测序和分析，找到了+Gz暴露影响小鼠BMSCs成骨分化的关键基因之一可能是Alpl。同时，转录组KEGG通路富集分析的结果为进一步探索+Gz暴露影响BMSCs成骨分化的潜在机制提供了研究基础，也为+Gz在骨再生领域的研究提供了更多理论支持。