经典名方当归四逆汤物质基准指纹图谱及关键质量属性量值传递规律研究

储烟阗 ，匡艳辉，严曾豪，王德勤，郭海彪，张偲偲*，刘晓秋*

1.广州白云山和记黄埔中药有限公司现代中药研究院，广东 广州 510000

2.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016

当归四逆汤（Danggui Sini Decoction，DSD），来源于张仲景的《伤寒论》，由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通、大枣7 味药组成，具有温经散寒、养血通脉的作用，主治血虚寒厥证[1-2]。现代药理研究表明，DSD 可用于痛经[3]、风湿性关节炎[4]、冠心病[5]、周围神经病变[6]、雷诺病[7]等诸多疾病的治疗，临床使用广泛。DSD 在2018 年国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》中为第13 方[8]。根据《伤寒论》原文记载，其煎煮方法为“当归三两，桂枝三两（去皮），芍药三两，细辛三两，甘草二两（炙），通草二两，大枣二十五枚（擘），上七味，以水八升，煮取三升，去滓，温服一升，日三服。”根据国家药品监督管理局2018 年5 月发布《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》[9]，经典名方复方制剂开发必须首先进行物质基准研究，为其后续的制剂开发提供依据。此外，国家药品监督管理局2019 年3 月发布《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准申报资料要求（征求意见稿）》[10]，经典名方的开发研究要首先明确其煎煮方法及投料规格等，且“原则上应与经典名方古代医籍记载一致”。

目前，关于经典名方DSD 的研究多见文献考证及临床应用，少见其多个成分含量测定方法及物质基准制备工艺的研究报道[11-12]，本研究拟建立DSD指纹图谱并结合3 种化学模式识别进行多维度质量评价，同时建立含量测定的方法。测定15 批DSD物质基准指纹图谱、指标成分的含量及出膏率，探究关键质量属性在饮片-水煎液-物质基准的传递规律，初步建立DSD 的全过程质量控制体系，为DSD后续复方制剂研究提供前期基础，并为其他经典名方的物质基准研究提供借鉴。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪，沃特世科技中国有限公司；KQ-600VDB 型双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；C21-SDHCB9E32S型电磁炉，浙江苏泊尔股份有限公司；CP225D 型十万分之一电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；Genie U12 型超纯水仪，上海乐枫生物科技有限公司；LDZ4-0.8 型离心机，北京医用离心机厂；FD-2D 型冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 材料

饮片信息如表1 所示，委托广州采芝林药房进行采购，经广州白云山和记黄埔中药有限公司匡艳辉制药高级工程师鉴定均属正品。DSD 流浸膏，批号为200601S，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。对照品阿魏酸（批号110773-201915，质量分数99.4%）、甘草苷（批号11610-201908，质量分数95.0%）、苯甲酸（批号100419-201703，质量分数99.9%）、绿原酸（批号110753-202018，质量分数96.1%）、芍药苷（批号110736-202044，质量分数96.8%）购自中国食品药品检定研究院；对照品芍药内酯苷（批号39011-90-0，质量分数90.5%）、甘草酸（批号1405-86-3，质量分数96.3%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。乙腈、乙酸为色谱纯，德国默克公司；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 DSD 物质基准的制备

采用随机数表法对表1（表1 中各味饮片委托广州采芝林大药房进行采购，均来自道地产区，每味饮片3 个产地，每个产地5 个批次）中15 批次各饮片进行随机组合并排序，组合信息见表2。通过本课题组前期考证及度量衡换算，宋代1 两折算为今3 g，大枣折算为24 g，1 升换算为200 mL，煎煮时间由原文记载的“煮取3 升”即可明确，煎煮时间确定为1.5 h，煎煮次数按原文记载为1 次，称取处方剂量当归9 g、桂枝9 g、白芍9 g、细辛9 g、木通6 g、甘草6 g、大枣24 g，置3 L 陶瓷罐中，加1600 mL[13]去离子水，武火1400 W 煮沸后转文火600 W 煎煮1.5 h，煎煮至600 mL，双层300 目筛网滤过，即得标准煎液，均匀取适量药液，4000 r/min 下离心（离心半径5 cm）10 min，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；取标准煎液50 mL，冷冻干燥，即得DSD 物质基准。

表1 DSD 饮片信息Table 1 DSD pieces information

表2 15 批DSD 物质基准样品组合信息Table 2 Information table of random combination of 15 batches of DSD substances

2.2 DSD 指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件 色谱柱为ACE Excel 3 C18-AR（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相为乙腈-0.2%乙酸水溶液，梯度洗脱：0～18 min，8%～10%乙腈；18～48 min，10%～14%乙腈；48～70 min，14%～17%乙腈；70～85 min，17%～21%乙腈；85～95 min，21%～21.5%乙腈；95～135 min，21.5%～45%乙腈；检测波长237 nm；体积流量0.6 mL/min；进样体积5 μL；柱温25 ℃。理论塔板数以芍药苷峰计算大于5000。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别取绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸、甘草苷、甘草酸适量，精密称定，加甲醇配制成质量浓度分别为30.10、167.70、277.50、35.50、42.45、170.40、144.30 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取DSD 流浸膏2 g（物质基准1.25 g），精密称定，置50 mL 量瓶中，加水定容，超声处理20 min，放冷，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液为供试品溶液。

2.2.4 指纹图谱方法学考察

（1）参照峰的选择：指纹图谱中，芍药苷的含量较高，且色谱峰稳定故选择芍药苷（峰6）作为指纹图谱的参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

（2）精密度试验：取DSD 流浸膏，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，连续进样6 次，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以芍药苷（峰6）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算其RSD 值。结果表明各共有峰的相对保留时间RSD 均≤0.32%，相对峰面积RSD 均≤3.84%，表明仪器精密度良好。

（3）重复性试验：按“2.2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，连续进样6 次，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。各共有峰的相对保留时间RSD 均≤0.53%，相对峰面积RSD 均≤3.81%，表明该方法重复性良好。

（4）稳定性试验：取DSD 流浸膏，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24 h 进样，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。各共有峰的相对保留时间RSD 值均≤0.28%，相对峰面积RSD 值均≤4.10%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.5 指纹图谱的建立及共有峰归属 按“2.1”项下制备物质基准取15 批DSD 物质基准、各单味药及阴性对照样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件对样品指纹图谱进行分析。以样品S1 的指纹图谱作为参照谱进行指纹匹配（中位数法，时间窗0.1 min），确定了16 个共有峰，并生成对照指纹图谱（R），15 批DSD 物质基准的HPLC指纹图谱叠加图见图1。15 批DSD 物质基准指纹图谱与对照图谱的相似度大于0.90。指认了其中16个共有峰，通过与对照品比较，分别为绿原酸（2 号峰）、芍药内酯苷（5 号峰）、芍药苷（6 号峰）、阿魏酸（7 号峰）、苯甲酸（8 号峰）、甘草苷（9 号峰）、甘草酸（15 号峰）。如图2 所示，其中1、4、9、10、13～16 号峰来自于甘草；2、3、11 号峰来自于木通；5、6、8、12 来自于白芍。15 批DSD 物质基准（S1～S15）相似度结果分别为0.996、0.987、0.990、0.994、0.993、0.991、0.993、0.991、0.989、0.985、0.993、0.901、0.974、0.991、0.972，相似度均大于0.90。其中S12、S13、S15 低于其他样品，说明不同批次药材制备的物质基准样品存在一定的质量差异。

图1 15 批DSD 物质基准HPLC 指纹图谱 (S1～S15) 和对照指纹图谱 (R)Fig.1 HPLC fringerprints (S1—S15) and control fringerprint (R) of 15 batches of DSD substances

图2 DSD 物质基准指纹图谱中16 个特征峰及其归属Fig.2 Specific peaks and their attribution in benchmark fringerprints of DSD substances

2.2.6 层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）[14]采用SPSS 25.0 数据分析软件，对15 批样品的共有峰的峰面积进行系统聚类，采用组间连接法，测量区间为平方欧氏距离，聚类结果见图3，结果发现当欧氏距离约为8 时，15 批DSD 物质基准可分为3 类，即样品S1～S11、S14 为第1 类，样品S13、S15 为第2 类，S12 为第3 类，此结果可与相似度评价结果相互印证。

图3 15 批DSD 物质基准HCA 谱系图Fig.3 Reference HCA pedigree of 15 batches

2.2.7 主成分分析（principal component analysis，PCA）选择15 批DSD 物质基准的16 个共有峰的峰面积为变量，导入SIMCA-P+14.1（Demo）软件进行PCA 处理，得分矩阵图见图4。15 批DSD物质基准可分为3 类，即样品S1～S11、S14 为第1类，样品S13、S15 为第2 类，S12 为第3 类，此结果可与HCA 结果相互印证。

图4 15 批DSD 物质基准PCA 得分矩阵Fig.4 PCA scoring plots of 15 batches of substance of DSD substances benchmarks of DSD

2.2.8 OPLS-DA 将15 批GSD 物质基准的16 个共有峰的峰面积导入SIMCA-P+14.1（Demo）软件进行OPLS-DA 处理，得分矩阵图见图5。结果发现15 批样品聚为3 类，结合以变量重要性投影（VIP）值＞1 为判定标准，筛选差异组分，见图6。结果共找到了4 个成分，按VIP 值大小排序分别为9（甘草苷）、10、15（甘草酸）、6（芍药苷）号峰。上述4 个差异成分中3 个来自甘草，1 个来自白芍，进一步说明严格控制甘草饮片质量是确保DSD 物质基准质量稳定的关键。

图5 15 批DSD 物质基准OPLS-DA 得分Fig.5 OPLS-DA scoring plots of 15 batches of substance benchmarks of DSD

图6 DSD 物质基准OPLS-DA 的VIP 值Fig.6 VIP values of OPLS-DA of DSD substance benchmarks

2.3 DSD 物质基准指标成分芍药苷、甘草苷、甘草酸定量测定

2.3.1 色谱条件 同“2.2.1”项下，3 个成分的理论板数均大于5000，分离度大于1.5。色谱图见图7。

图7 DSD 样品 (A) 和混合对照品 (B) 的HPLC 图Fig.7 HPLC of DSD sample (A) and mixed reference substances (B)

2.3.2 混合对照品溶液的制备 同“2.2.2”项下方法制备芍药苷、甘草苷、甘草酸混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 同“2.2.3”项下。

2.3.4 方法学考察

（1）线性关系考察：分别精密吸取适量“2.3.2”项下的混合对照品溶液，加甲醇稀释，得芍药苷质量浓度为13.88、27.75、55.50、111.00、222.00、277.50 μg/mL，甘草苷质量浓度为8.52、17.04、34.08、68.16、136.32、170.40 μg/mL，甘草酸质量浓度为7.22、14.43、28.86、57.72、115.44、144.30 μg/mL 的系列混合对照品溶液。取各个质量浓度的混合对照品溶液各5 μL 注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定各成分的峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：芍药苷Y=9 025.82X-1 653.98，r=1.000 0，线性范围13.88～277.50 μg/mL；甘草苷Y=17 790.30X-17 745.64，r=1.000 0，线性范围8.52～170.40 μg/mL；甘草酸Y=4 436.94X-2 084.58，r=1.000 0，线性范围7.22～144.30 μg/mL。结果表明，各成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。

（2）精密度试验：精密吸取中等质量浓度的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样分析6 次，分别计算峰面积。结果芍药苷、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD 分别为0.81%、1.00%、1.03%，表明仪器精密度良好。

（3）稳定性试验：精密吸取“2.3.3”项下方法制备所得的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取5 μL 供试品溶液并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果芍药苷、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD 分别为2.55%、2.56%、2.09%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

（4）重复性试验：根据“2.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别精密吸取5 μL 供试品溶液并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果流浸膏中芍药苷、甘草苷和甘草酸质量浓度平均值分别为4.427 9、1.075 6、2.192 8 mg/g，RSD 分别为2.80%、2.81%、2.87%，表明该方法重复性良好。

（5）加样回收率试验：取6 份已测定各成分量的流浸膏1 g，精密称定，分别加入芍药苷4.23 mg、甘草苷1.11 mg、甘草酸2.19 mg，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取5 μL 供试品溶液并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算各成分的平均回收率和RSD 值，结果芍药苷、甘草苷和甘草酸的平均加样回收率分别为98.81%、96.68%、100.75%，RSD 分别为2.17%、2.33%、1.78%，表明该方法准确度良好。

2.4 DSD 物质基准指标成分在饮片-水煎液-物质基准之间的量值传递分析

饮片的含量测定方法参考《中国药典》2020 年版，选取“2.3”项建立含量测定方法中具有特征性的白芍、甘草中的芍药苷、甘草苷及甘草酸探究其饮片-水煎液-物质基准的量值传递规律，DSD 物质基准水煎液中指标成分的测定按“2.1”项下制备供试品溶液及物质基准。

ω表示物质基准中指标成分的质量分数，m表示物质基准样品质量，W表示饮片中有效成分的质量分数，M表示处方中的饮片质量

各药味指标成分的含量及从饮片-物质基准转移率结果如表3 所示，芍药苷、甘草苷、甘草酸从饮片-物质基准平均转移率分别为52.94%、48.79%、47.39%。结果见图8。

图8 DSD 物质基准指标成分转移率Fig.8 Component transfer rate of DSD material benchmark index

表3 白芍及甘草药味指标成分含量及饮片-物质基准转移率Table 3 Content of medicinal flavor index components and reference transfer rate of decoction pieces and substances of paeoniflorin and glycyrrhizae

2.5 DSD 物质基准制备过程中各药味干膏率传递规律研究

按上述确定的工艺制备15 批次的DSD 物质基准样品，测定其干膏率。干膏率的测定方式为取100 mL（n=2）提取液或单味药材105 ℃烘干至恒定质量，计算公式为干膏率=6m/M，公式中6m表示干膏的质量，M表示各组称取的饮片量。比较全方的理论干膏率与实际干膏率的转移规律。

结果如图9 和表4 所示，15 批DSD 物质基准全方理论干膏率为24.26%～26.88%，实际全方干膏率为19.13%～24.58%，干膏率的平均转移率为86.40%。

表4 15 批DSD 单味药及物质基准干膏率及传递率结果Table 4 Results of 15 batches of DSD single drug and substance reference dry paste rate and transmissibility

图9 DSD 物质基准干膏率及传递率分析Fig.9 Analysis of DSD material standard dry paste rate and transmissibility

理论干膏率=∑(单味药干膏率×单味药生药量)/全方生药量

3 讨论

DSD 方中具有当归、桂枝、芍药、细辛、甘草（炙）、通草、大枣（擘）7 味药，方中桂枝辛温，温经散寒以通脉，与当归共为君药；白芍、细辛共为臣药，助桂枝温通血脉[15]。

原文记载的芍药、通草、细辛和甘草均为多基原药材，经过前期文献研究中进行的本草考证，并结合《伤寒论》所处历史时期，基本确定DSD 中所用的芍药药材基原为毛茛科芍药属植物芍药P.lactifloraPall.的干燥根；通草药材基原为木通科木通属植物木通A.quinata(Thunb.) Decne、三叶木通A.trifoliata(Thunb.) Koidz.的干燥藤茎；细辛药材基原为马兜铃科细辛属植物北细辛A.heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.的干燥根；甘草药材基原为豆科甘草属植物甘草G.uralensisFisch.的干燥根及根茎。其他3 味药所用基原均为《中国药典》2020 年版中各自药材基原，当归为伞形科当归属植物当归A.sinensis(Oliv.) Diels.干燥根，桂枝为樟科樟属植物肉桂C.cassiaPresl.干燥嫩枝，大枣为鼠李科枣属植物枣Z.jujubaMill.干燥成熟果实。方中甘草原文记载为“炙甘草”，经考证该炮制品为炒甘草，炮制方法取甘草片，照清炒法（炮制通则）炒至深黄色[16]。

课题组在建立指纹图谱和含量测定方法时，对比了4.6 μm 及3 μm 不同粒径色谱柱，3 μm 粒径的色谱柱分离度更好，因此，最终选择采用粒径为3 μm 的色谱柱，建立复杂中药复方制剂的含量测定方法，在流动相体积流量筛选过程中，由于色谱柱的内填物粒径较小，为3 μm，且色谱柱为150 mm的短柱，因此选用0.6 mL/min 的体积流量，从而避免高体积流量导致的高压对高效液相色谱仪器及色谱柱的损耗。

采用了Agilent 1260 和Waters 2695 高效液相色谱仪测定供试品溶液中各成分的含量，结果发现各成分含量差异不大；采用ACE Excel 3 C18-AR（150 mm×4.6 mm，3 μm）、Titank C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）、SuperLu C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）3 种品牌的色谱柱测定各成分含量、分离度、理论塔板数及拖尾因子，结果发现各成分含量差异不大，分离度良好，理论塔板数较高，拖尾因子符合要求，说明该含量测定方法的耐用性良好。

在供试品溶液的制备过程中，考察了水和不同体积分数的甲醇超声提取对各成分含量的影响，结果发现各成分含量差异不大，其中水提取的供试品溶液较为澄清且重复性较好，因此，选择水作为其提取溶剂以最大程度保留DSD 的物质概貌。课题组在前期建立色谱条件时，将桂皮醛纳入含量测定的范围中，但由于其性质不稳定且极性小在水中的提取率较低，最终在物质基准中的含量仅为0.01 mg/g，不建议对其进行含量检测，后续研究可考虑进行薄层色谱的鉴别。

在结合3 种化学模式进行15 批次DSD 物质基准多维度质量差异分析时，结果表明造成差异的主要原因来源于甘草中的甘草苷（峰9），其次是结合课题组后期质谱分析确定的芹糖甘草苷（峰10）及甘草酸（峰15），其原因可能是由于甘草不同部位对应含量不均匀而导致的差异[17]，此外，甘草不同产地的含量也存在一定差异，甘草中总皂苷、总黄酮和甘草酸含量较高的经度区间均在95°0＇～99°59＇和104°0＇～118°59＇，地理位置上这2 个点分别处于新疆与甘肃的交界、内蒙古与吉林的交界[18]，经典名方开发过程中建议采用道地产区的优质药材并严格按照饮片部位、大小等进行分类以确保物质基准的质量稳定性。

通过开展指纹图谱研究，共指认了16 个共有峰，15 批物质基准的相似度大于0.90。同时指认了绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸、甘草苷、甘草酸7 个成分，15 批物质基准中芍药苷、甘草苷、甘草酸的平均质量分数分别为8.267 8、2.533 3、5.160 5 mg/g，其中15 批物质基准芍药苷、甘草酸的质量分数均在均值的70%～130%，甘草苷含量范围为2.56～3.35 mg/g。芍药苷、甘草苷和甘草酸质量分数均大于1 mg/g，可作为含量测定指标，探究量值传递规律。

经典名方物质基准的制备工艺主要包括煎煮、滤过、干燥等工艺，本课题组前期通过考察煎煮工艺过程中所用的加热源、煎煮容器、加热火力、是否浸泡、过滤和干燥方法，确定了物质基准制备工艺的各项参数。以确定的工艺制备15 批次的物质基准，从指标成分的含量、特征图谱、干膏率3 个方面开展质量相关研究，拟从多个角度分析并阐述制备过程中的质量变化规律探究饮片-中间体-物质基准的量值传递规律，其中芍药苷、甘草苷、甘草酸从饮片-中间体的传递率接近50%，证明水溶性成分在制备过程中转移率高。在分析15 批次DSD 物质基准干膏率时，干膏率均在均值的±10%以内，但实际干膏率要低于理论干膏率的数值，其原因可能是由于单味药进行煎煮时其吸水量要大于全方进行煎煮时的吸水量，因此理论干膏率的数值要大于实际值[19]。

本实验建立DSD 指纹图谱及含量测定方法，从饮片入手探究饮片-中间体-物质基准的量值传递规律，证明DSD 物质基准在制备过程中其指标成分的含量、指纹图谱相似性及干膏率均稳定。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突