冬季衡水湖沉积物微生物群落结构特征及影响因素

曹洋，孙鹤铭，刘利*，敖蒙蒙，王俭，魏健

1.辽宁大学环境学院

2.中国环境科学研究院水生态环境研究所

沉积物是湖泊水体内部主要的污染物来源和微生物聚集地[1]，尤其是处于次好氧-厌氧状态的表层沉积物是多种营养物质转化的重要场所[2]，是参与湖泊水体物质循环的重要一环。已有研究表明，微生物群落特征的变化会影响沉积物中氮、磷营养物的化学循环及微生物的降解功能[3]，由微生物介导的有机物降解和转化是湖泊污染物周转过程的重要环节[4-5]。同时，微生物的群落结构也会受到营养盐浓度水平、水期变化、植物种类等多种环境因素影响[6-8]。湖泊不同湖区往往生境特征不同，对沉积物中微生物菌属和群落结构产生不同影响，从而影响沉积物中有机物和营养物的化学循环过程，进而对水体水质产生影响。因此，开展水体沉积物中微生物群落分布特征及其与环境因子相关性的研究，对针对性开展湖泊污染治理和生态修复具有重要意义。

衡水湖是华北平原上第一个国家级湿地自然保护区，其生态系统的健康稳定对维持周边乃至京津地区气候环境稳定性具有重要意义[9-10]。近年来，衡水湖外源污染（工业废水、农村生活污水和畜禽养殖等）已得到有效控制，然而衡水湖水体富营养化趋势仍不容乐观，内源污染已成为衡水湖治理与保护亟待解决的主要问题。目前，针对衡水湖内源污染的研究主要集中在营养盐形态分布、持久性有机物污染特征及重金属污染特征等方面[10-11]，而针对沉积物中微生物群落结构特征的研究尚未开展，尤其是冬季低温环境下沉积物微生物群落空间分布特征及其与环境因子响应关系的研究仍为空白。

笔者以冬季衡水湖不同湖区表层沉积物为研究对象，采用高通量测序技术对沉积物中微生物群落结构进行分析，探讨衡水湖生境特征差异引起的微生物群落结构特征及其多样性的变化，分析沉积物中微生物群落结构、多样性及其环境因子之间的响应关系，以期为衡水湖的治理与保护提供理论支持，同时也为类似湖泊的水环境保护提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况及样品采集

衡水湖（115°27′50″E～115°42′51″E，37°31′40″N～37°41′56″N）湖泊面积为 75 km2，东西长 22.28 km，南北长18.81 km，平均水深为3～4 m。所在区域属于暖温带大陆季风气候区，年平均气温为13 ℃，年降水量为518.9 mm[9-10]。

衡水湖湖北区种植有大量的芦苇、莲和紫萍等水生植物，植被覆盖度约为60%；湖心区历史上曾设立过渔场，目前水生植物生物量较少，植被覆盖度约为30%；湖南区历史上实施过挖掘工程，目前植被覆盖度约为15%。充分考虑衡水湖生境特征和周边环境因素，在湖区布设8个采样点，其中湖北区3个（S1～S3），湖心区 3 个（S4、S5、S8），湖南区 2 个（S6、S7）。采样点位置及信息见图1。

图1 沉积物采样点分布示意Fig.1 Map of sediments sampling sites

冬季湖泊水体和沉积物中污染物受外部因素影响较小，能较准确反映湖泊内源污染的真实状况[12]。于2020年12月在8个采样点采集表层沉积物(0～10 cm)样品及上覆水水样。上覆水水样尽快运回实验室测定化学需氧量（COD）、总氮（TN）、总磷（TP）、氨氮（NH3-N）等指标。沉积物样品采集后放入聚乙烯自封袋并尽快运回实验室，低温储存，冷冻干燥处理后用于测定TN、TP、有机碳（TOC）浓度及pH。另取一部分新鲜沉积物样品用于测定氨态氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3--N）、亚硝态氮（NO2--N）浓度。

1.2 水样与沉积物样品指标测定

根据《水和废水监测分析方法》4版[13]测定上覆水COD与NH3-N、TN、TP浓度。沉积物样品剔除沙石、动植物碎片等，使用冷冻干燥机预处理后进行研磨，过100目尼龙筛后装入聚乙烯塑料自封袋，放入冰箱，备用。采用烧失量法[9]测定沉积物中TOC浓度；运用连续提取法(SMT法)提取沉积物样品中TP，采用钼锑抗分光光度法测定沉积物中TP浓度；采用过硫酸盐氧化法[10]测定沉积物中TN浓度，采用氯化钾溶液提取-分光光度法测定沉积物中NH4+-N、NO3--N和NO2--N浓度。酸碱度采用pH计测定。

1.3 微生物高通量测序

用于微生物分析的样品送到上海美吉生物科技股份有限公司进行微生物组总DNA提取，完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。对提取的DNA进行PCR扩增，引物信息见表1。PCR采用 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 µL 反 应 体系，PCR仪为ABI GeneAmp® 9700型。全部样本按照正式试验条件进行PCR扩增，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。

表1 PCR扩增引物信息Table 1 PCR amplification primer information

1.4 数据分析

使用QIIME软件过滤、拼接和去除嵌合体，将运算分类单位（operational taxonomic units，OTU）在97%的相似水平划分，对OTU代表序列通过比对16S bacteria数据库进行分类学分析，根据最小样品的序列数抽平后，运用QIIME程序计算α多样性指数。其中，Shannon、Simpson指数用于评估物种多样性，Chao指数用来表征物种丰富度[12]，Coverage指数、Heip指数分别用来表征菌群覆盖率及均匀度[14-16]。利用R语言工具作图，得出不同分类水平下微生物群落结构柱形图。基于97%相似性的样本OTU数据和环境因子数据，运用R语言vegan包进行RDA（redundancy analysis）分析得出冗余分析图。使用R语言vegan包绘制样本间距离热图，通过计算环境因子与所选菌属之间的Spearman相关性系数，并基于R语言的pheatmap包绘制相关性热图。

2 结果与讨论

2.1 衡水湖上覆水及沉积物理化性质

冬季衡水湖表层沉积物理化指标如表2所示。由表2可知，衡水湖表层沉积物中TN平均浓度为1.987 mg/g，属中度污染水平；TP平均浓度为1.411 mg/g，属重度污染[17]；TOC平均浓度为50.941 mg/g，属有机污染水平[10,17]。整体而言，湖泊沉积物有机污染和磷污染问题较为严重，存在极大的磷释放风险，沉积物中高有机质浓度对氮盐的释放也有一定促进作用。沉积物中TN、TP和TOC平均浓度均表现为湖心区＞湖南区＞湖北区，表明湖心区沉积物营养盐污染状况最严重，这可能与湖心区有过水产养殖有关。各采样点表层沉积物中NH4+-N浓度为0.123～0.472 mg/g，NO3--N浓度为 0.011～0.164 mg/g，NO2--N浓度较低，均值为6.17 × 10-4mg/g。结果表明，沉积物中氮盐存在形式以NH4+-N为主，其中S8点位TN、TP、TOC、NH4+-N和NO3--N浓度较高，这与张嘉雯等[10]对衡水湖沉积物营养盐形态分布的研究结果一致。

表2 衡水湖冬季不同湖区表层沉积物理化指标统计Table 2 Statistics of physicochemical indexes of surface sediments in different areas of Hengshui Lake in winter

由衡水湖不同湖区采样点上覆水营养盐浓度（图2）可知，湖北区采样点上覆水TN浓度显著高于其余湖区采样点，而其沉积物中TN浓度低于其余湖区采样点。该现象与在白洋淀[7]的研究结果相似，可能是由于冬季湖北区大量衰亡的水生植物腐解，造成的厌氧环境加剧了沉积物中弱结合态氮的释放，从而导致上覆水TN浓度与其他湖区相比较高。湖心区上覆水及沉积物中TP和NH4+-N浓度均较高，这可能是由于湖心区历史上渔业养殖导致营养盐积累较多，内源负荷较高致使污染物二次释放到上覆水体中。

图2 衡水湖不同湖区采样点上覆水及沉积物中营养盐浓度Fig.2 Nutrient concentrations of overlying water and sediments at different sampling points in Hengshui Lake

2.2 沉积物微生物群落多样性分析

2.2.1 微生物α多样性分析

通过高通量测序，在97%的相似性度下将其聚类为用于物种分类的OTU，8个表层沉积物样品共得到 5 043个OTUs，分属61门、178纲、384目、556科、827属和1 668种。

计算不同采样点沉积物中微生物群落的α多样性指数，结果如图3所示。Shannon指数与物种多样性成正比，Simpson指数则与物种多样性成反比。由图3可知，各湖区Shannon指数平均值排序为湖北区（6.50）＞湖心区（6.20）＞湖南区（5.90），Simpson 指数平均值排序为湖南区（0.016）＞湖心区（0.009）＞湖北区（0.007）。湖北区、湖心区Shannon指数和Simpson指数存在极显著差异（P＜0.01）。各湖区沉积物的Heip指数平均值排序为湖北区（0.21）＞湖心区（0.18）＞湖南区（0.14）。Chao 指数平均值排序为湖北区（3 961）＞湖心区（3 662）＞湖南区（3 561），衡水湖各采样点沉积物Chao指数均高于白洋淀沉积物(1 354.96±645.82)[18]、华南地区的红树林沉积物(2 243±96)[19]。以上结果说明衡水湖表层沉积物中微生物群落多样性及丰富度较高。另外，各湖区Coverage指数均达到97%以上，表明衡水湖表层沉积物物种覆盖率较高。

图3 不同湖区各采样点沉积物中微生物群落α多样性指数Fig.3 Alpha diversity indexes of microbial communities of sediments at each sampling site in different lake areas

综上，衡水湖表层沉积物中微生物群落多样性较高，水体环境适宜微生物生存繁殖。水体沉积物中微生物群落多样性的结果为湖北区＞湖心区＞湖南区，湖北区与湖心区沉积物的微生物群落结构存在极显著差异。有研究表明，沉积物中细菌群落多样性随营养盐水平升高而下降，衡水湖湖北区水生植物覆盖度最高，水体自净能力也高，营养盐污染状况相对湖心区和湖南区较轻[7]。

2.2.2 微生物β多样性分析

在群落生态学中，β多样性指数聚焦于不同生境间多样性的比较[20]，可反映不同湖区间沉积物样品微生物群落结构的差异。以OTU水平做出样本相关距离热图，距离系数越大颜色越深，则表明2个采样点间存在的物种差异性越大。由不同采样点样本相关距离热图（图4）可以看出，各湖区颜色分化较明显，说明衡水湖各湖区沉积物中微生物群落结构存在较明显的差异。同处湖北区的S1和S2采样点距离系数最小，为0.207，说明大赵闸和南李庄村的微生物群落具有较高的相似度；S1和S8的距离系数最大，为0.455，说明大赵闸和小湖心的微生物群落差异性较大。研究表明，微生物群落结构特征的差异是微生物与水体环境长期相互响应的结果，在富营养化和接近富营养化的湖区水体中微生物群落多样性随着营养盐水平的升高而降低[21]，湖心区采样点沉积物中TN、TP、TOC、NH4+-N及NO3--N浓度远高于湖北区采样点，因此沉积物营养盐污染水平对微生物群落结构差异造成一定影响。除此之外，湖心区植物覆盖度低于湖北区，营养物质更多来源于历史的饵料投喂。因此，湖北区与湖心区沉积物的微生物群落结构差异明显，与不同区域环境、营养盐浓度及有机物组分差异有关。

图4 不同采样点样本相关距离热图Fig.4 Heatmaps of sample correlation distances at different sampling points

2.3 沉积物中微生物群落结构组成

2.3.1 门水平微生物群落结构

在门水平上，将相对丰度≥1%的微生物绘制成柱形图，结果如图5所示。由图5可知，沉积物中微生物群落在门水平上较为丰富，相对丰度较高的优势细菌门依次是变形菌门（Proteobacteria，28.8%～39.4%）、绿弯菌门（Chloroflexi，11.4%～23.5%）、脱硫菌门（Desulfobacterota，8.0%～12.2%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，5.0%～7.8%）、酸杆菌门（Acidobacteria，4.2%～8.9%）、放线菌门（Actinobacteria，4.3%～6.6%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，1.1%～2.9%），这7类优势类群在沉积物中的相对丰度均为60%以上。在很多湖泊沉积物的研究中，亦发现Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi和 Bacteroidetes为优势菌种类[22-23]。衡水湖与其他研究区域[24-27]水体沉积物微生物群落结构组成相似，但与其他研究区域水体沉积物的优势细菌门存在差异。湖泊表层沉积物中常见优势菌门有 Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Nitrospirae 和厚壁菌门（Firmicutes），除Firmicutes外，其他5个常见优势菌门均是衡水湖沉积物中的优势菌门。有研究发现，Firmicutes在黄河、鄱阳湖、太湖等水体沉积物微生物群落中均为优势菌门，但在我国辽河四平段流域、双台子河、辽河入海口等北部河流沉积物微生物群落中相对丰度较低[20]，这与衡水湖表层沉积物中Firmicutes相对丰度也较低的研究结果相一致。

图5 不同湖区采样点沉积物门水平微生物群落结构Fig.5 Microbial community structure at phylum levels of sampling sites in different lake areas

微生物相对丰度在湖北区和湖心区存在显著性差异（P＜0.05）的细菌门为 Chloroflexi、Desulfobacterota、Actinobacteria、Acidobacteria 和Nitrospirae， 这 些细菌门中相对丰度排序为湖北区＞湖心区的是Desulfobacterota、Acidobacteria 和Nitrospirae，说明这些细菌门更适宜在水生植物丰富的环境下生长。相对丰度排序为湖心区＞湖北区的细菌门是Chloroflexi和Actinobacteria，其中湖心区沉积物样品中Chloroflexi的相对丰度显著高于其他湖区。Chloroflexi为光能自养菌，与沉积物碳循环有关，具有发酵、固定CO2和乙酸化作用[28]，能在各种环境条件下较好生存，在有机污染物降解方面也发挥着重要作用[29]。湖心区历史上为养殖渔场，沉积物中有机质浓度明显高于其他湖区，可为Chloroflexi的生长繁殖提供有利条件。

湖南区和湖心区存在显著性差异（P＜0.05）的细菌门有 Chloroflexi、Desulfobacterota、Nitrospirae和Patescibacteria。其中，相对丰度排序为湖南区＞湖心区的是Desulfobacterota和Nitrospirae，说明这2个细菌门对营养盐浓度较敏感，更适宜在富营养化程度小的环境下生存；相对丰度排序为湖心区＞湖南区的细菌门是Chloroflexi和Patescibacteria，说明这2个细菌门适宜在营养盐丰富的环境下生存，其生长繁殖与湖心区沉积物营养盐污染严重有关。

2.3.2 属水平微生物群落结构

不同湖区采样点沉积物属水平微生物群落结构如图6所示。由图6可知，在属水平上，衡水湖各采样点物种相对丰度小于1%的菌属占比较大，这类菌属总丰度在36%以上，说明衡水湖表层沉积物的微生物丰富度较高，与其α多样性分析的结果一致。各湖区采样点沉积物优势分类群结构相似，不同湖区细菌群落差异主要体现在共有类群相对丰度的变化上。衡水湖表层沉积物的优势菌属是硫杆菌属（Thiobacillus，相对丰度10.1%～17.9%）、厌氧绳菌科（Anaerolineaceae）下的某属（相对丰度2.1%～11.3%）、类固醇杆菌科（Steroidobacteraceae）下的某属（相对丰度2.0%～6.5%）、Sva0081（相对丰度1.6%～2.5%）、P9X2b3D02（相对丰度0.9%～2.7%）和 SBR1031（相对丰度1.3%～3.0%）。

图6 不同湖区采样点沉积物属水平微生物群落结构Fig.6 Microbial community structure at genus levels of sampling sites in different lake areas

湖心区沉积物中Anaerolineaceae下的某属相对丰度是湖北区沉积物的2.27倍，是湖南区的4倍，但湖心区沉积物中P9X2b3D02的相对丰度是湖北区沉积物的0.67倍，是湖南区沉积物的0.74倍。与湖南区和湖北区沉积物相比，湖心区沉积物中相对丰度明显增大的菌属为Anaerolineaceae下的某属、SBR1031和Denitratisoma等。与湖心区和湖北区沉积物相比，湖南区沉积物中相对丰度明显增大的菌属为Thiobacillus、Sva0081和Steroidobacteraceae下的某属等。Thiobacillus不仅可以有效去除水体中的硝态氮[30]，还对硫的转化和降解有着显著作用，有助于提升水体自净能力。Sva0081是Desulfobacteraceae下的菌属，该科下菌属均为硫酸盐还原菌（sulfatereducing bacteria，SRB），SRB 为厌氧细菌，可将SO42-还原成H2S，对湖泊中硫和重金属的化学循环有积极作用[31]。Sva0081在湖南区沉积物中的相对丰度远高于其他湖区，这与湖南区沉积物高NH4+-N浓度有关，阴星望等[25]的研究也发现，该菌属相对丰度与NH4+-N浓度成正比，这与本研究结果一致。

Anaerolineaceae下 的 某 属 、P9X2b3D02和SBR1031相对丰度在湖北区和湖心区沉积物之间存在显著性差异（P＜0.05），P9X2b3D02 相对丰度排序为湖北区＞湖心区，说明该菌属更适宜在水生植物丰富的环境下生长繁衍。Anaerolineaceae下的某属和SBR1031相对丰度为湖心区＞湖北区，Anaerolineaceae下的某属是Chloroflexi下的厌氧细菌且在该门中占主导，具有发酵作用，可利用糖类和蛋白质进行代谢生长[32]，其在湖心区相对丰度最高。湖心区丰富的营养物质增强了底泥微生物的物质循环，该过程消耗大量氧气，有利于厌氧菌的繁殖生存。

2.4 微生物群落结构与环境因子相关性

2.4.1 冗余分析

在属水平上构建沉积物中微生物群落与沉积物理化性质的冗余分析图，结果如图7所示。图7中箭头长短代表环境因子与微生物菌属的相关程度，箭头越长，相关性越大，反之相关性越小[33]。由图7可知，沉积物TOC浓度对湖心区微生物群落结构影响较大，这与湖心区沉积物有机污染严重的状态相关。RDA1和RDA2共同解释了总体变化的80.41%，其中沉积物中TN、TP、TOC、NH4+-N、NO3--N和NO2--N浓度与第一主轴和第二主轴呈正相关，对湖心区沉积物细菌群落影响较大；沉积物pH与第一主轴呈正相关，与第二主轴呈负相关，对湖南区沉积物的细菌群落影响较大。

图7 不同湖区采样点沉积物中微生物菌属与沉积物理化指标冗余分析Fig.7 Redundancy analysis diagram of microbial genera and sediment properties of sediments at sampling sites in different lake areas

2.4.2 相关性分析

冗余分析只能从总体上反映环境因子与微生物菌属的关系，为了明确衡水湖冬季沉积物中微生物菌属与环境因子的相关性，将属水平优势菌属（分类水平丰度前30%）与环境因子进行Spearman相关性分析，结果如图8所示。

图8 微生物菌属与上覆水、沉积物理化指标相关性分析热图Fig.8 Heatmap of correlation analysis between microbial genera and physical-chemical indexes of overlying water and sediments

SBR1031作为绿弯菌门下的菌属[34]，其相对丰度与氮盐的浓度显著相关[35]。衡水湖沉积物中丰富的NH4+-N为SBR1031提供了充足的氮源，因而沉积物中SBR1031的相对丰度与NH4+-N浓度呈显著正相关（P≤0.05），这与高志伟等[35]的研究结果一致。Thiobacillus相对丰度与TOC浓度呈正相关，Denitratisoma相对丰度与TOC浓度呈极显著正相关（P≤0.001），该研究结果与白洋淀沉积物的研究结果[7]一致。Thiobacillus在湿地生态系统的C、N、S等元素循环中发挥着重要作用[36]，本研究结果进一步表明了Thiobacillus与碳的利用有密切关系。Sutterellaceae下的某属、P9X2b3D02、Aminicenantales下的某属及螺旋体属（Spirochaeta）等8个优势菌属的相对丰度与TOC浓度呈显著负相关（P≤0.05）。综上可知，沉积物TOC浓度对沉积物中多种菌属产生显著影响，这可能与衡水湖表层沉积物有机污染严重有关。已有研究发现，衡水湖沉积物中有机质可能主要来自陆生高等植物，芦苇、蒲草等植物凋谢后的残体可能是衡水湖沉积物中有机质的主要来源[10]。据此分析，衡水湖冬季沉积物碳源污染与该季节水生植物大量腐烂形成的生物沉积有关，碳源污染致使衡水湖沉积物内源污染严重。因此，加强植物残体清除和底泥疏浚是控制衡水湖内源污染的重点。

有机质、总氮、总磷浓度和pH等均会对沉积物微生物群落结构产生不同程度的影响[25]，不同区域不同水体的关键影响因素不同。已有研究表明，pH是鄱阳湖河口微生物群落的关键影响因素[26]，TP是洪泽湖西北部湿地沉积物微生物群落的关键影响因素[36]。本研究中，沉积物TOC浓度是衡水湖水体沉积物微生物群落结构的关键影响因素。

3 结论

（1）衡水湖表层沉积微生物群落多样性较高，水体环境适宜微生物生存繁殖。沉积物微生物群落多样性的结果为湖北区＞湖心区＞湖南区，湖北区与湖心区沉积物的微生物群落结构存在极显著差异（P＜0.01）。

（2）衡水湖各湖区沉积物中微生物群落结构在门和属水平上没有明显差异，但其在各湖区间相对丰度差异显著。在门水平上，湖心区沉积物中Chloroflexi的丰度显著高于其他2个湖区（P＜0.05），这与湖心区有机污染严重有关；在属水平上，湖北区沉积物样品中P9X2b3D02丰度显著高于其他2个湖区（P＜0.05），说明该菌属更适宜在水生植物丰富的环境下生长繁衍。

（3）沉积物中TOC浓度是衡水湖水体沉积物中微生物群落结构的关键影响因素，TOC浓度与微生物菌属的高相关性与沉积物有机污染严重有关，加强湖区植物残体清除和底泥疏浚是控制衡水湖内源污染的重点。