丁酸梭菌对肉鸡生长性能和体液免疫应答能力的影响

蒋玲艳，张 在，于 乐，秦张善，王林果

（1.广西农业职业技术大学 动物科技学院，广西南宁 530007；2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳 471000）

微生态制剂具有降低病原体入侵或定植引起疾病的风险，分泌病毒捕捉颗粒，降低病毒的传染性，提高动物免疫能力、生产性能等多种功能，正在成为抗生素替代品，广泛用于动物生产。目前应用于改善鸡生产性能、免疫性能的益生菌种类较多，包括乳杆菌、分支杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、丁酸梭菌等。但益生菌调节鸡的生长性能和免疫性能的效果跟多种因素有关，需要进行详细研究（简宗辉等，2021；刘珂飞等，2021；Alquazlan等，2021）。丁酸梭菌属于厌氧型芽孢梭菌，存在于人和动物肠道，具有耐胃酸、耐高温、耐多种抗生素，且能提高机体免疫力、改善肠道组织结构、促进消化吸收、维持肠道屏障能力等功能，作为一种新型绿色的微生态制剂，已成为人们研究的热点，并广泛应用于人类疾病治疗及动物养殖生产上（王宗伟等，2022；范雪等，2021；Stoeva等2021）。禽流感（Avian influenza，AI）和新城疫（Newcastle disease，ND）是危害养鸡业的两种主要急性传染病。禽流感病毒不单攻击呼吸道，还会对鸡的肠道造成破坏，导致鸡肠道黏膜上皮细胞连接方式发生改变，产生严重的继发感染。疫苗免疫是目前预防鸡免遭这些传染病侵袭的重要手段之一，但由于病毒毒力变异及各种因素的影响，疫苗免疫难以完全有效控制这些传染病的爆发，因此，疫苗接种联合益生菌使用会成为这些疾病的综合防控途径。本试验联合新城疫病毒-禽流感病毒灭活疫苗免疫和丁酸梭菌的使用，研究分析了丁酸梭菌对鸡生长性能和体液免疫的影响，为科学应用丁酸梭菌饲养肉鸡及综合防控鸡新城疫和禽流感提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组及免疫 试验将90只1日龄健康麻黄肉鸡（购自广西富凤农牧集团）随机分成3组，每组3个重复，每个重复10只鸡，采取单层笼养方式饲养在本校动物养殖场，自由采食与饮水，试验为期84 d。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮+丁酸梭菌（低剂量2×105CFU/g和高剂量5×105CFU/g）。各组鸡分别于1和21日龄颈部皮下接种新城疫病毒-禽流感病毒二联灭活疫苗 0.3 mL/只。

1.2 试验试剂 丁酸梭菌网购自佳美生物，活菌 数 5亿 CFU/g。 新 城 疫 病 毒（LaSota株）-禽流感病毒（H9亚型）二联灭活疫苗（批号为160022133），由普莱柯生物工程有限公司提供。新城疫血凝抑制试验用抗原、阳性血清与阴性血清（批号为154028082），购自青岛立见生物科技有限公司。小鸡基础日粮（破碎颗粒料）：漓源小鸡配合饲料121T（3周龄内）和511（3周龄以上），购自南宁市元亨兽医服务中心。

1.3 免疫器官指数和肠道指数的测定 分别于21、42、63、84日龄时每组随机挑取 3只鸡，分别称量个体活重，然后屠宰分离出脾、胸腺、法氏囊，称量三者总重量，计算免疫器官指数。同时分离出十二指肠、空肠、回肠和盲肠、直肠，除去肠中内容物后称量每只鸡整个肠道的重量，计算肠道指数，具体公式如下：

肠道指数/%=个体肠道总重量/个体活重×100；

免疫器官指数/%=个体免疫器官总重量/个体活重×100。

1.4 日增重、日采食量和饲料转化率的测定 每3周称量一次鸡只体重和饲料消耗量，计算鸡只平均体重和平均饲料消耗量，然后计算日增重和日采食量，并计算饲料转化率，具体公式如下：

饲料转化率/%=平均日增重/平均日采食量×100。

1.5 血清分离 二免疫后14 d起，每周固定时间分别从对照组和试验组鸡群中随机采集6只鸡翅静脉血，待血液凝固后收集血清，于3000 rpm离心5 min，保存上清液，用于新城疫抗体（Newcastle disease antibody，ND Ab） 和 禽流 感 H9亚 型 抗 体（Avian influenza H9subtype antibody，AI H9Ab）效价测定，连续采集血清 8 周。

1.6 新城疫抗体（ND Ab）和禽流感抗体（AI H9Ab）的测定 用血凝试验和血凝抑制试验（Hemagglutination inhibition test，HI）测 定 ND Ab效价和 AI H9Ab效价。ND Ab效价测定按照国家标准《新城疫诊断技术》（GB/T16550-2020）执行，记录测定数据，计算HI（log2）结果平均值。AI H9Ab效价由广西璞缔恩葳生物科技有限公司一次性全部检测。

1.7 数据统计与分析 试验数据用Excel整理后，使用GraphPad Prism 6.01软件进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，采用t检验，P＜0.05表示组间差异显著，P＜0.01表示组间差异极显著。

2 结果与分析

2.1 丁酸梭菌对免疫器官指数与肠道指数的影响 由表1可知，21日龄鸡丁酸梭菌高剂量（5×105CFU/g）组免疫器官指数稍高，各组鸡的免疫器官重量指数均在42日龄时最高，其中对照组最高，但丁酸梭菌低剂量（2×105CFU/g）组和高剂量组无显著差异（P＞0.05），整个试验期间随日龄的增加，对照组和试验组鸡的免疫器官指数变化趋势基本一致，且同日龄阶段各组免疫器官指数无显著差异（P＞0.05）。各组鸡肠道指数随日龄增加呈下降趋势，21日龄时肠道指数最高，之后逐渐下降。21日龄时，丁酸梭菌低剂量组和高剂量组鸡的肠道指数均高于对照组（P＞0.05），21～63日龄丁酸梭菌低剂量组肠道指数高于丁酸梭菌高剂量组和对照组，但各组之间无显著差异（P＞0.05）。84日龄时，丁酸梭菌低剂量组肠道指数明显低于对照组（P＜0.01），丁酸梭菌高剂量组与对照组无显著差异（P＞0.05）。

表1 丁酸梭菌对肉鸡免疫器官指数和肠道指数的影响 %

2.2 丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响 由表2可知，整体看，对照组和试验组鸡只在前3周内生长最慢，日增重最少，但饲料转化率较高，之后生长速度加快，21～42日龄日增重最快。0～21日龄，对照组的平均日增重显著高于试验组（P＜0.05），丁酸梭菌低剂量和高剂量组鸡平均日增重无显著差异（P＞0.05）；0～21日龄对照组饲料转化率极显著高于丁酸梭菌低剂量组（P＜0.01），与丁酸梭菌高剂量组无显著差异（P＞0.05），且丁酸梭菌高剂量组饲料转化率显著高于低剂量组（P＜0.01）。21～42日龄，丁酸梭菌高剂量组日增重显著高于低剂量组和对照组（P＜0.05），饲料转化率极显著高于低剂量组和对照组（P＜0.01），对照组日增重和饲料转化率与丁酸梭菌低剂量组无显著差异（P＞0.05）。42～63日龄，丁酸梭菌低剂量组日增重和饲料转化率显著高于对照组和高剂量组（P＜0.05），丁酸梭菌高剂量组与对照组无显著差异（P＞0.05）。63～84日龄，丁酸梭菌低剂量组和高剂量组的日增重与对照组无显著差异（P＞0.05），低剂量组饲料转化率显著高于对照组和高剂量组（P＜0.05），高剂量组与对照组无显著差异（P＞0.05）。整体看，丁酸梭菌对鸡生长性能的影响与鸡的日龄和添加丁酸梭菌的量有关。与对照组相比，除前三周外，在饲料中添加丁酸梭菌可以提高鸡日增重和饲料转化率。42日龄前在肉鸡饲料中添加高剂量（5×105CFU/g）丁酸梭菌组的饲料转化率显著高于低剂量（2×105CFU/g）组（P＜0.05）；42日龄后添加丁酸梭菌低剂量的饲料转化率显著高于高剂量组和对照组（P＜0.05），高剂量组与对照组无显著差异（P＞0.05）。三组鸡的终末平均体重基本一致，丁酸梭菌低剂量组饲料转化率显著高于对照组（P＜0.05），与高剂量组无显著差异（P＞0.05），添加丁酸梭菌组平均日采食量低于对照组。

表2 丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响

2.3 丁酸梭菌对肉鸡体液免疫应答能力的影响为研究丁酸梭菌对鸡体液免疫应答能力的影响，对照组和试验组鸡全部于1和21日龄颈部皮下接种新城疫病毒-禽流感病毒（H9亚型）二联灭活疫苗。第二次免疫后14 d开始，每周定期采血分离鸡血清，用HI试验测定新城疫抗体（ND Ab）效价和禽流感H9亚型抗体（AI H9Ab）效价，计算HI（log2）平均值。由表3可知，二次免疫后14 d时，对照组ND Ab和AI H9Ab的平均效价均高于丁酸梭菌组，但与丁酸梭菌组差异不显著（P＞0.05）。丁酸梭菌低剂量组和对照组在二免35 d时ND Ab和AI H9Ab平均效价均达到最高值，两组的ND Ab平均效价最高值一致，均为9.7 log2，但丁酸梭菌低剂量组的AI H9Ab平均效价最高达到 10.7 log2，极显著高于对照组的 9.0 log2（P＜0.01），而对照组AI H9Ab平均效价显著高于丁酸梭菌高剂量组（P＜0.05）。二免28 d后，丁酸梭菌低剂量组的ND Ab和AI H9Ab的平均效价均高于对照组和高剂量组，高剂量组略低于对照组（P＞0.05）。在整个试验期间，各组血清ND Ab和AI H9Ab平均效价变化趋势基本一致，均表现出一定的波动，在二次免疫后的63 d内无明显的规律性，其中丁酸梭菌高剂量组的ND Ab和AI H9Ab效价最高值和整体平均效价均低于对照组（P＞0.05），而丁酸梭菌低剂量组的ND Ab和AI H9Ab效价在达到最高值后平均效价稍高于对照组（P ＞ 0.05）。

表3 丁酸梭菌对肉鸡体液免疫应答能力的影响

3 讨论

丁酸梭菌为革兰氏阳性厌氧杆菌，具有促进肠道有益菌群增殖、发育，抑制有害菌繁殖，产生多种维生素等作用，其主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质，不受胃酸、胆汁酸等影响，作为新饲料添加剂在动物养殖方面广泛应用（范雪等，2021）。试验结果表明，21日龄内的肉鸡，与对照组比较，在饲料中添加5×105CFU/g丁酸梭菌可稍微提高免疫器官指数和肠道指数，为后期营养消化、吸收和体液免疫打好生理基础。但试验持续到84日龄时发现，丁酸梭菌低剂量组肠道指数低于对照组和高剂量组，具体原因需要进一步研究。研究发现，丁酸梭菌可增加幼禽肠道重量指数，并不是增加肠道长度，而是增加了肠道绒毛的长度和厚度（李修宇等，2021；蒋一秀等，2021；韦晓芳等，2021）。因此，21日龄后在饲料中添加2×105～5×105CFU/g丁酸梭菌能显著提高日增重和饲料转化率，与武丽达等（2022）的研究结果基本一致。从84 d的试验期看，在42日龄内的肉鸡饲料中添加5×105CFU/g丁酸梭菌可以改善鸡的免疫器官指数和肠道指数，提高饲料转化率。对于42日龄以上的肉鸡，日粮中添加2×105CFU/g丁酸梭菌对日增重和饲料转化率的效果优于添加5×105CFU/g丁酸梭菌。长期在饲料中添加丁酸梭菌对麻黄肉鸡的终末体重影响不显著，但可以提高饲料转化率，降低饲料成本。

由表3可知，试验组在二次免疫14 d的ND Ab和AI H9Ab平均效价均低于对照组，且个体差异比较大，存在效价低于免疫临界值4 log2的个体（1/6），可能跟拌料均匀度有关。二次免疫21 d后，各组新城疫和禽流感H9个体免疫率和群体免疫率均达到100%。二次免疫35 d后，丁酸梭菌低剂量组和对照组的ND Ab和AI H9Ab平均效价均达到最高值，且丁酸梭菌低剂量组的AI H9Ab最高效价明显高于其他两组，而丁酸梭菌高剂量组的ND Ab和AI H9Ab峰值低于其他两组，且没有明显峰值。表明在麻黄肉鸡饲料中添加合适剂量（2×105CFU/g）的丁酸梭菌能提高鸡对新城疫和AI H9灭活疫苗的免疫应答能力，从而提高抗体效价和抗体持续时间。而在饲料中添加高剂量（5×105CFU/g）的丁酸梭菌反而对鸡的体液免疫应答能力没有正向效果，从而导致血清抗体效价不高，其机理需要进一步研究。

4 结论

综上所述，在42日龄内的肉鸡饲料中添加高剂量5×105CFU/g的丁酸梭菌可改善免疫器官指数和肠道指数，提高日增重和饲料转化率。对于42日龄以上的肉鸡，饲料添加低剂量2×105CFU/g的丁酸梭菌对鸡日增重、饲料转化率和体液免疫应答能力等综合性能的提高较好，且能提高麻黄肉鸡灭活疫苗免疫后的AI H9Ab峰值和持续时间，而高剂量5×105CFU/g的丁酸梭菌对麻黄肉鸡的新城疫和禽流感疫苗的体液免疫应答没有提高作用。因此，丁酸梭菌对家禽生长性能和免疫性能的效果不仅要考虑使用剂量、饲喂方式，还要考虑家禽的日龄。