响应面法优化黑水虻抗菌肽提取工艺研究

胡文举，孙英菲

（河南开放大学，河南郑州 450046）

抗菌肽具有热稳定性好、抗菌谱广、不易产生耐药性、对高等动物正常细胞几乎无害等特点。杜红等（2022）研究表明，将抗菌肽添加到饲料中能提高动物生长性能、免疫功能、血清抗氧化功能和促进肠道发育（张书会等，2022；李美茹等，2020）。黑水虻又称亮斑扁角水虻，是联合国粮农组织推荐的可饲用昆虫之一（Van，2013）。自然环境下黑水虻幼虫体内可产生抗菌肽来抵抗病原微生物。夏嫱等（2013）对黑水虻幼虫进行食源性人工诱导，使其产生具有抑菌活性的抗菌肽成分。目前，黑水虻抗菌肽的制备途径主要包括直接从幼虫体内分离、化学合成和生物工程制备（Müller等，2014）。由于成本低、耗时短、工艺简单、抗菌效果稳定等优点，直接分离法成为目前黑水虻抗菌肽制备的常用方法。本研究采用响应面设计对黑水虻抗菌肽提取工艺进行优化，以期为黑水虻抗菌肽的产业化开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与主要试剂 黑水虻虫卵购自河南某黑水虻繁育基地；金黄色葡萄球菌菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

EDTA-2Na、NaCl、蛋白胨、琼脂粉、固体硫酸铵、去离子水、酵母提取物、无水乙醚等均购自国药集团化学试剂有限公司；透析袋购自上海源叶生物科技有限公司；超滤管购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

LB 培养基 ：10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，15 g 琼脂，1000 mL 蒸馏水。

1.2 主要仪器设备 DHG-3000AE型电热烘干箱：无锡展霖环境科技有限公司；BILON-DFT-100A型粉碎机：上海比朗仪器制造有限公司；JIDI-16D离心机：广州吉迪仪器有限公司；BXP-65型生物培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；MKZ-G2A真空冷冻干燥箱：青岛迈可威微波创新科技有限公司；超低温冰箱MD-86L58：美的集团股份有限公司；BBS-H1800超净工作台：济南好来宝医疗器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑水虻的饲养与诱导 将孵化72 h后的黑水虻幼虫置于饲养盒内饲养至5龄期，在饲养基质内加入5 mL含有金黄色葡萄球菌（3×1012个/mL）的菌液继续饲养24 h。

1.3.2 样品预处理 取适量的黑水虻幼虫，用纯净水冲洗干净，吸干水分，50℃烘干至恒重，研磨粉碎，索氏提取法脱脂，破壁机粉碎过70目筛后冷冻保存。

1.3.3 黑水虻抗菌肽的提取 称取10 g脱脂黑水虻幼虫粉，加入含0.9% NaCl的EDTA缓冲液，按照试验设计进行浸提。浸提后8层纱布过滤，8000 r/min 离心 15 min，取上清液加入硫酸铵（质量百分比浓度70%），搅拌至充分溶解，4℃静止4 h，10000 r/min 离心 15 min，弃上清液。参照张弘弛等（2021年）的方法，将黑水虻幼虫粗蛋白提取物用1 kD透析袋4℃下透析24 h，期间换液3次。将透析后的粗蛋白加入到10 kD超滤管内，5000 r/min 离心 1 h，收集管底液，真空冷冻干燥称重后保存。

1.3.4 抗菌肽提取率的测定 抗菌肽提取率=抗菌肽的质量/黑水虻虫干的质量

1.3.5 抗菌肽抗菌活性的检测 以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用牛津杯扩散法测定黑水虻抗菌肽的抑菌活性（李美茹等，2010）。试验设阴阳性对照，其中，阴性对照为灭菌蒸馏水，阳性对照为4 U/mL青霉素。将LB平板置于37℃条件下连续培养24 h，测量抑菌圈的直径，每组试验重复3次，计算平均值。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验 参考相关文献（韩玉竹等，2019），在预试验基础上分别研究液料比（2∶1、4∶ 1、6∶ 1、8∶ 1、10 ∶ 1 g/mL）、浸提时间（4、8、12、16、20 h）、超声功率（10、30、50、70、90 W）对黑水虻抗菌肽提取率和抗菌活性的影响。

1.4.2 响应面试验 在单因素试验的基础上，以液料比、浸提时间和超声功率为自变量，以提取率为响应值，利用Box-Behnken试验设计原理进行3因素3水平响应面优化试验，利用Design-Expert 10.07软件进行分析。响应面优化试验因素与水平见表1。

表1 响应面优化试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对抗菌肽的影响 由图1可知，黑水虻抗菌肽的提取率随液料比的增加呈现先上升后下降的趋势。当液料比为6∶1时，提取率达到最高值1.03%，但与4∶1和8∶1组差异不显著（P＞0.05），当液料比达到10∶1时抗菌肽提取率最低，为0.64%，与4∶1、6∶1和8∶1组差异极显著（P＜0.01），与2∶1组差异不显著（P＞0.05）。从抑菌效果看，2∶1组抑菌圈直径最小，为11.32 mm，与其他组相比差异极显著（P＜0.01）。因此，在响应面优化设计时选择液料比6∶1作为中心试验点。

图1 液料比对黑水虻抗菌肽的提取率及抑菌性能的影响

2.1.2 浸提时间对抗菌肽的影响 由图2可知，黑水虻抗菌肽提取率随浸提时间的增加呈上升趋势，浸提时间为4 h时，抗菌肽提取率最低，为0.71%，与其他组差异极显著（P＜0.01）。当浸提时间达到12 h时抗菌肽提取率最高，为1.26%，但与 8、16、20 h 组差异不显著（P ＞ 0.05）。浸提时间对黑水虻抗菌肽的抑菌效果影响各组之间差异不显著（P＞0.05）。因此，确定黑水虻抗菌肽最佳浸提时间为12 h，并将浸提12 h作为响应面试验设计的中心点。

图2 浸提时间对黑水虻抗菌肽的提取率及抗菌性能的影响

2.1.3 超声功率对抗菌肽的影响 由图3可知，超声功率为30 W时，黑水虻抗菌肽提取率比10 W时显著提高，当超声波功率达到50 W时黑水虻抗菌肽的提取率最高，达到1.14%。随功率的提高，提取率有下降趋势。当超声波功率大于70 W时，提取的抗菌肽抑菌效果呈显著下降趋势，抑菌圈直径显著低于10、30和50 W组。综合考虑提取率和抑菌效果，最佳超声功率选定为50 W，每10 W一个梯度。

图3 超声功率对黑水虻抗菌肽的提取率及抑菌性能的影响

2.2 响应面优化试验结果 根据响应面优化试验所得数据，经回归拟合得到二次多项回归方程为：

Y=1.4678-0.1011A+0.0279B+0.0193C+0.01 4AB+0.0653AC-0.0243BC-0.2742A2-0.1871B2-0.1829C2

回归模型方差分析见表2。由表2可知，该模型P＜0.01，模型整体达到极显著水平，失拟项P＞0.05，失拟项不显著，说明该模型拟合较好，能准确反应液料比、浸提时间和超声功率对抗菌肽提取率的影响。模型决定系数R2=0.9641，说明不到5%的变异无法利用该模型进行解释。矫正决定系数，拟合决定系数，说明该模型可靠，预测值与实际值之间误差较小，能准确预测和分析黑水虻抗菌肽最佳提取工艺参数和结果。回归模型中一次项A和二次项A2、B2、C2对黑水虻抗菌肽提取效率影响达到极显著水平（P＜0.01）。各因素对黑水虻抗菌肽提取率影响顺序为A＞B＞C。

表2 回归模型分析结果

2.3 响应面交互作用分析 利用Design-Expert 10.07软件绘制3个因素交互作用对黑水虻抗菌肽提取率影响的响应面图（见图4）。由图4可知，液料比和超声功率的交互作用对抗菌肽提取率影响最为显著，浸提时间分别与液料比和超声功率的交互作用均不明显。

图4 液料比、浸提时间、超声功率对提取率交互作用的响应面图

2.4 最佳提取工艺的确认与验证 根据模型分析结果，黑水虻抗菌肽最佳提取条件为液料比6.964、浸提时间 12.335 h、超声功率 51.338 W，此时黑水虻抗菌肽的提取率预测值为1.360%。为便于验证试验的进行，将提取条件修正为液料比7.0，浸提时间 12 h，超声功率 50 W。按照修正条件进行3次平行验证试验，测得该条件下黑水虻抗菌肽的提取率为1.34%，与预测值非常接近，说明该模型准确可行，所确定的提取条件可靠。此外，3次平行验证试验所提取的抗菌肽抑菌圈直径为（12.68±0.72）mm，与各单因素试验最高值相比差异不显著（P＞0.05），表明最佳提取条件下提取的抗菌肽抑菌效果稳定。

3 讨论

随着抗菌肽功能研究的不断深入，抗菌肽的提取也越来越受关注。抗菌肽的提取受提取温度，提取液种类、比例，提取时间，辅助手段等多种因素的影响，并且各因素之间还存在互作效应。本研究采用响应面设计，在单因素试验的基础上对液料比、浸提时间、超声功率3个因素之间的互作效应进行研究，以探索黑水虻抗菌肽的最佳提取工艺。在单因素试验中，料液比对黑水虻抗菌肽提取率的影响趋势与李美茹等（2020）在红线虫上的研究类似，可能是因为液料比过低时，虫体内抗菌效果较强的多肽不能充分溶解，随着提液料比的增大，虫体内的抗菌肽被充分溶解在提取液内，但当液料比过高，抗菌肽凝析不完全，反而影响了提取效果。随着浸提时间的增加，黑水虻抗菌肽提取率呈先上升后稳定的趋势，可能是因为浸提12 h左右，黑水虻幼虫体内的抗菌肽已经达到静态下所能提取的极值。在浸提过程中，随着超声波功率的提高，抗菌肽提取率先呈现上升趋势，当功率达到50 W后提取率达到最高值，随后随着功率的继续增大，提取率和抗菌效果均呈显著下降趋势，这主要是因为提取过程中辅以超声波能加快提取液的振动频率，促进提取液进入黑水虻组织，有利于抗菌肽的提取，超声功率过大则会破坏抗菌肽的结构，从而影响提取效果和抑菌效果（许依能等，2022）。利用响应面设计对3个影响因素进行优化，建立最优提取条件的二次多项回归模型，通过对模型的分析可知，液料比和超声功率的交互作用对抗菌肽提取率影响最为显著，其余交互作用均不显著，模型预测的最佳提取条件为液料比6.964、浸提时间12.335 h、超声功率51.338 W，提取率预测值为1.360%，对提取条件进行修正和验证得知，抗菌肽提取率可以达到1.34%，与预测值基本契合，提取率比优化前提高了6.35%。

4 结论

本研究在单因素试验的基础上，对黑水虻抗菌肽的提取条件采用响应面法进行优化。结果表明，黑水虻抗菌肽的最优提取条件为液料比7 ∶ 1，浸提时间 12 h，超声波功率 50 W，在此条件下，提取的抗菌肽提取率为1.34%，抗菌肽抑菌圈直径为（12.68±0.72）mm。说明该条件下提取的黑水虻抗菌肽提取率高，抑菌效果恒定，可为今后黑水虻产业化开发应用提供依据。