土壤锑胁迫下赤子爱胜蚓在个体和细胞水平的毒性效应

2023-02-04程佳琪马宏瑞潘明慧李琴莲

环境科学研究 2023年1期

关键词：赤子蚯蚓毒性

程佳琪，马宏瑞，常健，潘明慧，李琴莲，王谦，侯红

1. 中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

2. 陕西科技大学，陕西西安 710021

3. 华北理工大学，河北唐山 063000

4. 生态环境部土壤与农业农村生态环境监测技术中心，北京 100012

锑(Sb)是一种有毒的类金属元素，被广泛用于陶瓷、玻璃、电池、油漆、烟火材料及阻燃剂生产[1-3]，在土壤中多以五价存在. 据调查，贵州晴隆锑矿区周围农田土壤Sb含量(13.65～410.91 mg/kg)远高于贵州背景值(2.24 mg/kg)，湖南某锡矿区表层土壤Sb浓度最高可达54 221.71 mg/kg[4-5]. 这些锑矿的开采严重污染环境且对周围生物有毒害作用[6]. 例如，某锑矿区男性工人肺癌死亡率在新增Sb加工作业后显著上升[7]；五价的葡萄糖锑酰钠会引起小鼠蛋白尿、降低红细胞数及血糖水平、增加白细胞数及血尿素等症状[8]. Feng等[9]研究发现，一定浓度Sb胁迫下，水稻体内丙二醛(malondialdehyde, MDA)及地上部株体超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(aseorbateperoxidase, APX)增加，根中过氧化物酶(peroxidase, POD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性受到抑制.

蚯蚓是土壤中分布最广泛的无脊椎动物之一，占到土壤生物量的80%[10-11]. 蚯蚓吸收微量金属不仅会对自身产生毒性，而且可以通过食物链进行传递[12-13].因此蚯蚓被认为是生态风险评估的重要组成部分，常通过测定其个体水平死亡率、繁殖率，细胞水平酶活性及DNA损伤等指标进行土壤污染的生态毒理学诊断[14-17]. 目前国内外有关Sb对蚯蚓的研究还比较缺乏，只有少数文献报道，如Xu等[18]研究表明，在黏性农业土壤中蚯蚓不能有效积累Sb；Kuperman等[19]提供了Sb对蚯蚓繁殖的毒理学数据；梁淑轩等[20]研究了Sb对蚯蚓体内金属硫蛋白的影响；Zhong等[21]研究了农业土壤中锑对蚯蚓的毒性效应. 这些研究大多从对蚯蚓进行短期急性毒性试验展开，且与对蚯蚓进行抗氧化酶试验的结果不一致，缺乏Sb长期暴露对蚯蚓体内累积及毒性评价的研究. 因此，土壤Sb对蚯蚓毒性的研究还存在许多不足，丰富Sb胁迫下生态受体的毒理数据很有必要.

本文以土壤无脊椎模式生物赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为受试生物，在人工模拟Sb污染土壤中进行两个月的长期培养后，从个体水平和细胞水平等多个毒性终点探究Sb对赤子爱胜蚓的影响. 同时，检测了Sb暴露过程中蚯蚓体内5种生物标志物(总蛋白、CAT、SOD、POD和MDA)的变化，并使用生物标志物响应指数(biomarker response index, BRI)来综合评估土壤Sb胁迫下赤子爱胜蚓在细胞水平的毒性效应，以期为我国锑污染提供关键毒理学数据，为以后锑矿区周围污染土壤生态治理提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试生物

Eisenia fetida购自北京坤龙养殖场. 试验开始前将其放在20 ℃室内养殖两周以上，定期加入燕麦作为食物. 试验过程中选用活泼、体态相似的成熟蚯蚓，质量在300～500 mg范围内[22-23].

1.1.2供试土壤

供试土壤为人工土壤，由10%的泥炭土、20%的高岭黏土、69%的工业石英砂(含50%以上0.05～0.20 mm的细小颗粒)组成，并用1%的CaCO3调节pH为7左右，用去离子水调节含水量为50%.

1.2 试验方法

1.2.1污染土壤样品制备

试验选用的五价锑盐为焦锑酸钾(KSbO6H6，分析纯)，将称好的药品加热溶解，使用喷壶进行人工土壤染毒. 试验在2 000 mL烧杯中进行，在烧杯中添加500 g人工土壤，5 g牛粪，使用搅拌器充分拌匀. 所有土壤在20 ℃恒温箱(光照周期为16∶8的光暗循环，湿度为50%)中老化两周后进行毒性试验. 试验Sb含量设置为空白(0 mg/kg)、低剂量(400、800 mg/kg)、高剂量(1 600、3 200、6 400、12 800 mg/kg)3种浓度梯度，分别以CK、S1、S2、S3、S4、S5、S6表示，每组设置3个平行. 期间通过称量法向烧杯中添加去离子水使土壤含水量保持在50%左右.

1.2.2蚯蚓毒性试验

试验参照OECD指南和ISO[24-25]，整个试验期间控制温度为(20±2) ℃，光照周期为16∶8的光暗循环、光照强度为400～800 lx、土壤含水量为50%. 试验开始前将称量好的蚯蚓置于装有湿滤纸的烧杯中，在20 ℃恒温箱中进行24 h清肠处理. 在装有不同Sb含量土壤的烧杯中分别加入10条清肠后的赤子爱胜蚓，置于人工气候箱中培养，期间不添加牛粪，其他培养条件同赤子爱胜蚓饲养条件. 试验分两组进行，其中一组用于毒性测试，每隔一天用去离子水补充水分并使用玻璃棒和镊子协助计数，计算LC50；另一组用于酶活性和蚯蚓体内Sb积累测定. 所有处理均分别在培养第7、14、21、28、56天取样，每组取3个平行. 用于酶活性测定的蚯蚓取两条制成匀浆置于4 ℃冰箱备用，用于含量测定的蚯蚓取3条进行冷冻干燥后备用.

1.2.3蚯蚓体内Sb含量测定

蚯蚓体内Sb含量测定参照《食品安全国家标准食品中多元素的测定》(GB 5009.268-2016). 称取冷冻干燥后的蚯蚓干样0.5 g于消解内罐中，加入5 mL浓硝酸，放置1 h后在微波消解仪中170 ℃消解4 h，冷却后将消解内罐取出，在超声水浴箱中超声脱气5 min，用超纯水定容至25 mL后过0.45 μm滤膜备用. 用ICP-MS(7800型，美国安捷伦公司)测定溶液中的Sb含量.

1.2.4总蛋白、抗氧化系统酶、丙二醛的提取及测定

取两条蚯蚓在0.86%生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入50 mL小烧杯内. 加入9倍体积生理盐水，用眼科小剪剪碎组织块后置于事先冰浴好的玻璃匀浆管中，充分研碎，使之匀浆化. 制备好的匀浆在高速冷冻离心机(TGL-16.5M，上海卢湘离心机仪器有限公司)中以2 000 r/min离心15 min，取上清液进行总蛋白、CAT、POD、SOD、MDA测定. 所有测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，按说明书进行.

1.3 数据处理

1.3.1LC50计算及剂量效应关系拟合

该研究用Logisitic方程拟合实测总Sb含量对赤子爱胜蚓存活的LC50[26]：

式中：y为赤子爱胜蚓存活率；x为实测总Sb含量，mg/kg；a为对照组中赤子爱胜蚓的存活数；x0为LC50；b为方程拟合过程中所产生的斜率参数.

分别采用WPS office 2021、SPSS 19.0软件进行数据统计，采用SPSS 19.0和Origin 8.0软件进行数据分析和绘图.

1.3.2生物标志物响应指数

根据文献使用生物标志物变异水平(Alteration level，AL)和生物标志物响应指数(BRI)来评价Sb对赤子爱胜蚓的健康影响. AL的计算公式如下：

式中：BRt和BRc分别为污染处理组和对照组的生物标志物响应水平；AL为生物标志物变异水平，根据变异水平大小进行评分(Score, S). 当AL＜20%时，评4分；当20%＜AL＜50%时，评3分；当50%＜AL＜100%时，评2分；当AL＞100%时，评1分[27]. 然后根据生物标志物的生物学水平对其进行加权，SOD、CAT、POD、总蛋白为正常效应，权重为1；MDA是一个不利的影响，权重为1.2[28]. 最后基于分数和权重，计算BRI：

式中，Sn和Wn分别为生物标志物n的得分和权重.此外，对BRI进行划分：介于3.01～4.00之间时，表示轻微健康影响；介于2.76～3.00之间时，表示中等健康影响；介于2.51～2.75之间时，表示较大健康影响；介于1.00～2.50之间时，表示严重健康影响[29].

2 结果与分析

2.1 不同暴露时间土壤外源Sb对蚯蚓毒性的影响

图1为蚯蚓存活与实测总Sb的Logisitic方程拟合. 由图1可以看出，蚯蚓存活率随Sb浓度和暴露时间增加而降低. 根据存活率结果，采用SPSS 19.0软件进行双变量相关性分析，发现蚯蚓存活率与暴露浓度呈现显著性负相关(P＜0.05)，并且在高剂量(3 200、6 400、12 800 mg/kg)处理条件下，存活率与暴露时间呈显著负相关(P＜0.05). 另外经计算蚯蚓56 d的LC50为4 380.37 mg/kg.

图1 蚯蚓存活率与土壤实测总Sb的剂量-效应关系Fig.1 Dose response curves between the survival rate of Eisenia fetida and the total concentration of Sb in soil

2.2 蚯蚓对Sb的富集

从图2可以看出，蚯蚓体内Sb含量随暴露时间和暴露浓度增加而增加. 在低剂量暴露下其含Sb量较低，当Sb含量超过3 200 mg/kg时，蚯蚓体内Sb含量显著升高. 处理组S6在第14、28、56天的Sb富集量分别达到94.8、177、213 mg/kg.

图2 不同暴露时间赤子爱胜蚓对Sb的富集Fig.2 The Sb concentration of enriched within Eisenia fetida under different exposure times

表1为不同处理组蚯蚓Sb富集系数(bioaccumulation factors，BAF)，BAF为蚯蚓体内Sb含量与土壤中Sb含量的比值，BAF大于1说明蚯蚓对Sb有富集，BAF小于1说明蚯蚓对Sb只是一般吸收[30]. 如表1所示，所有处理组BAF均小于1，说明蚯蚓对Sb富集作用很小，只起到一般吸收作用. 由表1可知，蚯蚓Sb富集系数随处理剂量升高整体显著降低；另外，随时间延长，蚯蚓Sb富集系数呈现上升趋势.

表1 不同试验组蚯蚓锑富集系数Table 1 Sb bioconcentration factors of Eisenia fetida in different experimental groups

2.3 土壤Sb胁迫下蚯蚓体内总蛋白含量、抗氧化酶活性和MDA含量的变化

由图3(a)可知，随暴露时间延长蚯蚓体内总蛋白含量明显下降. CK在暴露时间内缓慢下降，降幅为28.6%，各处理组总蛋白含量较CK显著降低(P＜0.05)，在暴露时间内降幅分别为1.5%～44.4%、25.3%～59.3%、15.1%～49.7%、28.3%～64.2%，且各处理组总蛋白含量在暴露时间内随Sb水平增加呈剂量效应关系.

图3 暴露期间赤子爱胜蚓总蛋白含量、CAT活性、POD活性、SOD活性和MDA含量的变化情况Fig.3 The changes of total protein content, CAT activity, POD activity, SOD activity and MDA content in Eisenia fetida during exposure

由图3(b)可知，CK组CAT活性随暴露时间延长基本不变. 各处理组CAT与CK相比，整体差异性显著(P＜0.05)，在暴露第7天，各处理组CAT活性显著升高，S6处理组最高升至219.5 U/mg Prot，较CK涨幅120%；在暴露第14天，除S6处理组继续升高外，其余处理组出现下降趋势；在暴露第21天，蚯蚓体内CAT活性继续升高，高剂量处理组S4、S5、S6达到峰值. CAT活性在随暴露时间内总体呈现“上升—下降—上升—下降”的波动趋势.

由图3(c)可知，CK组POD活性随暴露时间延长呈先升后降趋势，在暴露7～21 d各处理组POD活性与CK相比无显著性差异(P＞0.05)；在暴露第28天各处理组与CK相比显著上升(P＜0.05). 除S5处理组外，各处理组在第21天POD活性达到峰值，分别为0.046、0.044、0.039、0.049、0.059 U/mg Prot，涨幅分别为39.4%、34%、17%、47%、79%. POD活性在暴露时间内总体呈现先升高后降低的倒“U”型变化.

由图3(d)可知，CK组SOD活性随暴露时间延长总体呈先升后降趋势. 在暴露7～21 d各处理组SOD活性随时间不断上升，处理组S3、S5、S6在第21天达到峰值，分别为4.14、3.88、4.5 U/mg Prot，较CK涨幅为78.4%、67.0%、94.0%；在暴露第28天，低剂量处理组SOD活性继续上升，而高剂量处理组S5、S6出现下降趋势. SOD活性在暴露时间内总体呈现先升高后降低的倒“U”型变化.

由图3(e)可知，在暴露7～21 d，MDA含量随时间延长整体不断升高，处理组S2、S3、S4、S5在第21天达到峰值，分别为1.04、1.15、1.43、1.14 nmol/mg Prot，较CK涨幅分别为7.9%、19.0%、47.3%、18.0%，并且在暴露第21天，MDA含量呈现低浓度促进高浓度抑制现象；在暴露第28天各处理组MDA活性整体呈现下降趋势. MDA在暴露时间内总体呈现先升高后降低的倒“U”型变化.

2.4 土壤Sb对蚯蚓毒性的综合评价

表2为各处理组在4个时间的生物标志物变异水平及得分. 总体而言，随处理水平增加，AL呈现上升趋势，表明土壤Sb浓度越高，生物标志物变异水平越大. 总蛋白、CAT、SOD、MDA和POD的变异水平范围分别为1.5%～68.7%、 9.3%～271.6%、 5.6%～94.0%、1.1%～58.7%和1.0%～123.7%. 在所有生物标志物中，CAT变异水平最大，其中处理组S4在21 d分别达到271.60%，表明在3 200 mg/kg处理水平下，蚯蚓CAT变异水平大幅升高.

表2 生物标志物变异水平及得分Table 2 Level of variation and corresponding scores of biomarkers

图4为蚯蚓生物标志物响应指数随时间的变化情况，BRI值越低，说明蚯蚓受伤害程度越高. 由图4可知，在第7、21、28天各处理组BRI随时间延长整体不断下降，第14天，BRI呈现“降低—升高—降低”的变化趋势. 各处理组在4个时间的BRI值分别为2.81～3.42、2.81～3.62、2.00～3.19、2.19～3.01. 处理组S5、S6在第7 天时BRI分别为2.85、2.81，表明高剂量处理组在较短时间内出现中等健康影响. 随暴露时间延长，低剂量处理组在第14天出现中等健康影响，BRI值为2.85. 在4个时间段内，BRI最低值为2，说明处理组S6在第21天受到严重健康影响. 在所有处理组中，仅有4个处理组蚯蚓属于严重健康影响，其余处理组均在中等及以下健康影响.

图4 赤子爱胜蚓在锑胁迫下的生物标志物响应指数Fig.4 The biomarker response index of Eisenia fetida under Sb stress

3 讨论

该研究中，蚯蚓对Sb的累积随时间延长和处理水平增加不断增多，但在所有处理组中，蚯蚓对Sb都是简单吸收. 这可能是由于Sb在土壤中的水溶态占比非常小[1]，而蚯蚓主要通过皮肤从土壤孔隙水吸收Sb[31]，或者蚯蚓把含Sb土壤通过进食后又排出体外，对Sb的积累行为非常有限[32]. BAF随处理剂量降低也说明蚯蚓对Sb的积累能力较弱，但是在较长时间暴露下蚯蚓对Sb仍有一定的积累量. 在蚯蚓接触Sb后，其体内抗氧化酶不断响应来抵抗外来侵害，直至达到抗氧化极限，蚯蚓细胞受损开始死亡[33]. 所以随时间延长和浓度升高蚯蚓死亡率不断上升. 蚯蚓死亡率与Sb水平呈剂量效应关系，这与已有的研究结果[34]一致. 经计算蚯蚓暴露56 d时的LC50为4 380.37 mg/kg. 在对其他生物的研究中，有研究显示Sb(Ⅲ)对跳虫的急性死亡LC50在海伦黑土、祁阳红壤、北京潮土中分别为3 352、4 007、2 105 mg/kg[35]. Lin等[36]研究显示，与Sb(Ⅲ)相比，Sb(Ⅴ)处理土壤中的跳虫死亡率没有明显变化. 通过对比可以看出，本文所研究的Sb(Ⅴ)对赤子爱胜蚓的毒性效应在个体水平较低.

蚯蚓在接触Sb后体内迅速产生活性氧(ROS)，抗氧化酶的作用是消除ROS维系膜系统稳定，降低细胞受伤害程度，因此被作为生物标志物被广泛用于重金属风险评估[37-38]. SOD作为生物体抗氧化系统的第一道防线[39-40]，首先得到诱导与活性氧自由基作用，将超氧阴离子(O2-)歧化成O2和H2O2. CAT与POD的作用是将SOD的歧化产物和其他来源的H2O2清除，二者具有很好的协同作用[41]. MDA是机体抗氧化平衡中自由基作用于脂质形成的氧化最终产物，能够较好反映蚯蚓的氧化系统受损程度[42]. 该研究中CAT的变化趋势与前人对镧的研究结果[43]一致. 在暴露初期CAT迅速上升，Zhou等[44]研究也发现，在短期作用下，蚯蚓对Cd2+氧化应激反应产生的酶主要是CAT. SOD、POD活性在暴露时间内均呈现先升后降的倒“U”型变化趋势，这是因为暴露初期，抗氧化酶活性不断升高，可以有效去除蚯蚓体内活性氧.暴露后期，当Sb含量超过蚯蚓耐受阈值时，蚯蚓细胞受到严重伤害，应激能力下降. 另外，D'agostino等[45-46]研究也表明，抗氧化酶SOD、POD在清除由正常代谢或环境应激引起的自由基方面存在一定的相互协同效应. MDA含量呈现倒“U”型变化趋势，可能是因为暴露初期蚯蚓体内抗氧化酶的清扫能力低于自由基产生速度，过剩的氧自由基引起膜的过氧化，使MDA含量不断升高[47-48]，但随时间延长，过剩的活性氧在抗氧化酶活性最高时得到清除，使蚯蚓体内活性氧的生成和去除达到平衡，MDA含量逐渐降低趋于平稳. 蚯蚓体内总蛋白含量随暴露时间和处理水平增加而不断减少，说明在土壤Sb的胁迫下，蚯蚓不断消耗能量来进行解毒和排泄过程[49]. 同时随浓度增加和时间推移，蚯蚓机体功能受损，抑制了蛋白质的合成[50]. 由此可以看出，在暴露期间内，蚯蚓体内5种生物标志物均对Sb做出敏感响应.

生物标志物响应指数BRI是在为鱼类制定的生物效应评估指数(BAI)和健康评估指数(HAI)之后制定的[51]，其优点是将复杂的生物改变转化为一种实用的手段进行风险评估和风险管理，来减少风险评估中的不确定性. 在对BRI的探究中，Aarab等[52]基于BRI创建了一个全球指数(多生物标志物污染指数)，该指数已在欧洲计划应用. Narbonne等[53]利用全球生物标志物指数，对欧洲沿海地区水质进行了分类.近几年一些国内学者开始利用BRI来评价土壤中重金属、农药等污染物对赤子爱胜蚓的毒性效应. 例如，Li等[27]利用BRI评价了环草隆和镉对蚯蚓的联合毒性，发现BRI与污染物暴露浓度之间存在显著的剂量效应关系. 本文通过BRI来评价土壤中Sb对赤子爱胜蚓的毒性发现，高剂量处理组在短期内出现中等健康影响，低剂量处理组随时间延长也出现中等健康影响，但只有个别处理组属于严重健康影响，表明土壤Sb对赤子爱胜蚓的影响在细胞水平较低.

总而言之，本文通过探究土壤Sb胁迫下赤子爱胜蚓死亡率、Sb富集、酶活性等指标，发现总蛋白、CAT、SOD、POD和MDA对Sb敏感，基于这5种生物标志物的BRI能够有效评价土壤Sb的污染程度，为土壤Sb污染生态风险评价提供了关键生态毒理学数据. 但蚯蚓在土壤Sb胁迫下的生物标志物响应仅能表征细胞水平的毒性效应，且具体机理尚不明确，应进一步在分子水平上解析Sb对蚯蚓的毒性机制.