基于Src/VEGF 轴探究补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移的作用机制

胡玉蝶，王晓丽，焦方敏，杨 争，袁 博，胡金辉*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤疾病[1-2]，其主要死亡原因是远处转移的发生，骨骼是该病最常见的转移部位，发生率高达70%～85%[3-4]，临床症状多为局部或全身疼痛、病理性骨折、高钙血症等，严重影响患者生活质量[5]。 目前，西医主要治疗方法有骨改良药物的应用、抗肿瘤治疗、手术治疗、镇痛治疗等，但毒副作用较多且疗效有限[6]。 近年来，中医药基于辨证论治、因人制宜的特点，在防治乳腺癌骨转移中取得良好疗效，临床上越来越多的患者选择中西医结合疗法防治乳腺癌骨转移[7]。补肾活血汤出自《伤科大成》，乃治疗乳腺癌骨转移临床常用方[8-9]，本研究利用网络药理学预测补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移的作用靶点，并行实验验证，旨在揭示补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移的内在分子机制，为其临床进一步应用提供科学依据。

1 材料

1.1 动物与细胞

15 只健康BALB/c 6～8 周龄雌性裸鼠，饲养于湖南中医药大学动物中心实验室，饲养温度24～26 ℃，湿度为50%～70%，许可证号：SYCK(湘)2020-0038。乳腺癌4T1-luc 细胞株（批号：CL-0007）购自普诺赛公司，本实验已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会，批准编号：LL2021041404。

1.2 主要药品与试剂

Src 抗体（批号：ab109381）、MMP1 抗体（批号：ab52631）均购自英国Abcam 公司；VEGF 抗体（批号：13687-1-AP）、内参β-肌动蛋白（β-actin）（批号：66009-1-Ig）、NFATc1 抗体 （批号：66963-1-Ig）、HRP goat anti-rabbit IgG（批号：SA00001-2）、HRP goat anti-mouse IgG（批号：SA00001-1）均购自美国proteintech 公司。

补肾活血汤药物组成：熟地黄12 g（批号：2106031）、杜仲15 g（批号：21050406）、枸杞子15 g（批号：HH21050701）、补骨脂15 g（批号：HY21051901）、菟丝子15 g（批号：CK21042906）、当归尾12 g（批号：TH2105702）、没药6 g（批号：21051901）、山茱萸15 g（批号：SX21052806）、红花6 g（批号：SX21051301）、独活15 g（批号：TH21052606）、肉苁蓉15 g（批号：2105245），均购自湖南中医药大学第一附属医院，张裕民主任药师鉴定为正品，药品质量均符合《中华人民共和国药典》（2020 年版）规定[38]。

1.3 主要仪器

煎药壶（一壶百饮有限公司，型号：FTS-10A）；旋转蒸发仪（中天仪器科技有限公司， 型号：RE-2000A）；摇床（其林贝尔公司，型号：TS-1）；化学发光成像系统（勤翔公司，型号:ChemiScope6100）；小动物标本Micro-CT 成像系统（美国GE 公司，型号：Super Nova CT）；医用诊断X 射线仪器（威图科技有限公司，型号：E7242X）。

2 方法

2.1 网络药理学

2.1.1 补肾活血汤中药成分收集及作用靶点预测 运用中药系统药理学数据库与分析平台数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，检索补肾活血汤11 味中药成分信息，以口服生物利用度(OB)≥30%、药物类药性(DL)≥0.18 为滤过条件，筛定活性成分；利用PubChem 数据库(http://pubchem.Ncbi.Nlm.nih.gov/)获取各活性成分的SDF 结构式或SMILES 码并导入Swiss Target Prediction 数据库(http://www.swisstarge tpredi-ction.ch/)收集补肾活血汤的潜在作用靶点。

2.1.2 乳腺癌骨转移疾病靶点筛选 在GeneCards数据库(https://www.Genecards.org/)中以“Bone metastasis of breast cancer”为检索词检索，获得乳腺癌骨转移疾病治疗靶点。

2.1.3 补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移潜在靶点筛选及PPI 网络构建 将乳腺癌骨转移疾病靶点与补肾活血汤潜在作用靶点导入韦恩软件工作平台（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），获取补肾活血汤活性成分治疗乳腺癌骨转移的潜在作用靶点，并绘制韦恩图。

将补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移潜在作用靶点导入STRING(https://string-db.org/)数据库，限定物种为Homo sapiens；Required score 为0.900；FDR Sstringency 为high，获得PPI 相关信息。 利用Cytoscape 3.9.0 软件对PPI 网络可视化， 并对其行Degree、Be tweenness、Closeness 算法拓扑分析，获取补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移核心靶点。

2.1.4 GO、KEGG 富集分析 运用WebGestalt(http://www. webgestalt.org/)数据库，ORA 算法，导入拓扑分析靶点，GO、KEGG 富集分析，获取BP、CC、MF 及KEGG 富集分析数据，权重分析后绘制火山图。

2.2 体内实验验证

2.2.1 补肾活血汤中药制备 补肾活血汤单付剂量141 g，取3 付，根据《医疗机构中药煎药室管理规范〔2009〕》煎煮。 第一次加8 倍量水（3384 mL）浸泡30 min，煎煮30 min，趁热过滤；余药渣再加6 倍量水煎煮30 min，过滤，合并2 次水煎液，旋转蒸发仪（70 ℃，-0.1 MPa）浓缩至约116 mL，分装，备用。

2.2.2 细胞培养 乳腺癌4T1-luc 细胞复苏后用含有10%胎牛血清、1%青-链霉素溶液的DMEM 培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，每天换液。造模时取对数生长期细胞，用PBS 配制成浓度为5×106个/μL细胞悬液，保存至冰上备用，全程无菌操作。

2.2.3 动物分组 健康Balb/c 6～8 周龄裸鼠共15只，每笼5 只。 适应性喂养3 d，确认无烈性传染病且已适应新环境后根据体质量将其标号，采用随机数字表法将裸鼠分为3 组，分别为对照组、模型组、补肾活血汤组，每组5 只。

2.2.4 选用胫骨骨髓腔内注射乳腺癌细胞建立乳腺癌骨转移模型 裸鼠造模前用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.4 mL/20 g）。 麻醉完毕后固定于操作台，75%酒精消毒左侧后肢皮肤，屈曲膝关节呈90°，确定胫骨平台位置。模型组、补肾活血汤组组裸鼠均用26G 显微注射器针头从胫骨近端向胫骨远端斜下缓慢旋转刺入骨髓腔，针尖有落空感并部位固定，用显微注射器吸取10 μL 4T1-luc 细胞悬液，缓慢注入骨髓腔，注射完毕后针头在胫骨内停留1 min，随后退针局部压迫，对照组裸鼠用上述方法向骨髓腔内注射10 μL PBS。 最后将裸鼠均放置于37 ℃恒温板上，苏醒后放回笼中饲养。

2.2.5 给药方法 造模5 d 后，补肾活血汤组裸鼠每天补肾活血汤中药液灌胃1 次（0.01 mL/g）（给药剂量为36.67 g/（kg·d）；对照组、模型组以生理盐水灌胃（0.01 mL/g）。 连续给药14 d。

2.2.6 检测指标与方法 （1）裸鼠体质量监测：造模第1 天、干预第4、7、11、14 天各称量体质量1 次。

（2）肿瘤组织HE 染色形态学观察：4%甲醛溶液固定胫骨组织144 h，脱钙，脱水后石蜡包埋，切片，60 ℃烤片12 h，脱蜡至水，将切片置二甲苯中20 min，重复3 次，乙醇梯度脱水，苏木素染色，蒸馏水冲洗，PBS 返蓝，伊红染复染，蒸馏水冲洗，梯度酒精脱水，取出后置于二甲苯10 min，2 次，封片，显微镜下观察。

（3）裸鼠胫骨微CT 检测：将裸鼠左后肢固定在微CT 载物台上，设定360°扫描角度、10 μm 分辨率，获取连续的平面CT 图像并进行三维重建，分析胫骨骨破坏面积百分比（胫骨骨破坏面积百分比=胫骨骨破坏面积÷胫骨总面积）。

（4）裸鼠胫骨X 线检测：药物干预结束后将裸鼠眼眶取血处死，分离患侧后肢置于X 线成像系统中拍照观察。

（5）胫骨组织TRAP 染色：4%甲醛溶液固定胫骨组织，脱钙，脱水，石蜡包埋，切片，60 ℃烤片1～2 h，再将切片置于二甲苯中，梯度酒精脱水。 TRAP孵育液37 ℃避光浸染70 min、流水冲洗，苏木素复染，蒸馏水冲洗，PBS 返蓝，梯度酒精脱水。取出后置于二甲苯中，封片、镜下观察，阳性细胞为酒红色。

（6）Western blot 检测：取新鲜胫骨组织0.025 g，加250 μL RIPA 裂解液并反复研磨组织，冰上裂解，4 ℃离心，检测上清蛋白浓度。电泳，转膜，封闭，依次一抗（Src 抗体，1∶10 000 稀释、VEGF 抗体，1∶500 稀释；MMP1 抗体，1∶1000 稀释；β-actin 单克隆抗体，1∶5000 稀释）、二抗（HRP goat anti-mouse IgG，1∶5000 稀 释；HRP goat anti-rabbit IgG，1∶6000 稀释）与膜一起各孵育90 min。 使用ECL 化学发光液显色曝光。 Image Lab Software 软件测定光密度，以目标蛋白与β-actin 条带比值表示相对表达量。

（7）免疫组化检测：甲醛溶液固定胫骨组织，脱钙，石蜡包埋，切片，脱蜡至水，热修复抗原，室温加1%高 碘 酸，PBS 冲 洗 后 滴 加 一 抗（Src、VEGF、MMP1、NFATc1 均1∶100 稀释） 4 ℃过夜，PBS 冲洗，滴加二抗（抗兔-IgG 抗体-HRP 多聚体）37 ℃孵育30 min，DAB 显色，苏木素复染，PBS 返蓝，酒精脱水。置于二甲苯后封片、镜下观察。阳性染色为棕黄色或褐色，Image J 软件分析图像平均光密度(Average IOD）。

2.2.7 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件进行统计分析，计量资料满足正态分布，则用“±s”表示，方差齐性时用单因素方差分析，组间比较采用LSD 法；不满足方差齐性时采用多个独立样本比较的秩和检验；不满足正态分布时，采用Kruskal-Wallis 秩和检验。 P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 网络药理学分析结果

3.1.1 补肾活血汤有效成分及作用靶点筛选结果运用TCMSP 数据库收集活性成分，其中熟地黄2 个、杜仲28 个、枸杞子45 个、补骨脂42 个、菟丝子11 个、当归尾2 个、没药45 个、山茱萸20 个、红花25 个、独活9 个、肉苁蓉6 个。 通过PubChem 数据库获取上述成分SDF 结构式或SMILES 码，导入SwissTargetPrediction 数据库预测补肾活血汤潜在作用靶点，去除重复值且保留唯一值，共得1443 个补肾活血汤药物潜在靶点。

3.1.2 乳腺癌骨转移疾病靶点筛选结果 运用GeneCards 数据库，获得乳腺癌骨转移疾病靶点共6973 个。

3.1.3 药物与疾病共同靶点筛选结果及PPI 网络构建 将乳腺癌骨转移疾病靶点6973 个与补肾活血汤潜在靶点1443 个取交集，并绘制韦恩图（图1 A），得药物与疾病的共同靶点949 个（如MMP7、EP300 等）。运用Cytoscape软件对PPI 相关信息网络可视化（图2）；同时对PPI 网络进行Degree、Closeness、Between ness算法拓扑分析，并行可视化（图1B 和图1D）。 PPI网络中，有933 个节点（16 个无交集靶点不纳入统计），4525 条边，富集P 值＜1.0e-16。运用Degree、Closeness、Betweenness 算法拓扑分析得出PPI 网络中排名前十的核心靶点（见表1），整合后收集到核心靶点共15 个（如SRC、TP53 等）。

图1 共同靶点韦恩图、拓扑分析网络图

图2 PPI 网络图

表1 前10 位Degree、Closeness、Betweenness 算法拓扑分析结果

3.1.4 拓扑分析靶点GO 与KEGG 富集分析 BP

共富集605 个生物进程，整合FDR、ratio 与P 值结果并进行权重分析，绘制火山图(图3A)，主要富集于正向调节防御反应、类固醇激素的反应、共价染色质修饰等生物进程。CC 共富集52 个细胞组分，整合FDR、ratio 与P 值结果并进行权重分析，绘制火山图(图3B)，主要富集于受体复合物、膜区、细胞外基质等细胞组分。 MF 共富集117 个细胞功能，整合FDR、ratio 与P 值结果并进行权重分析，绘制火山图(图3C)，主要富集于蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、类固醇激素受体活性、蛋白异源二聚体活性等细胞功能。 KEGG 共富集179 个信号通路，整合FDR、ratio 与P 值结果并进行权重分析，绘制火山图(图3D)，主要富集于MAPK 信号通路、cAMP 信号通路、细胞凋亡等相关通路。

图3 GO、KEGG 富集分析火山图

3.2 体内实验验证结果

3.2.1 体质量监测结果 造模第1 天，各组裸鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）；干预第14 天，模型组体质量较对照组明显下降（P＜0.01），与模型组比较，补肾活血汤组体质量明显增加（P＜0.01）。详见表2。

表2 各组裸鼠体质量比较（±s,g）

表2 各组裸鼠体质量比较（±s,g）

注：与对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与造模第一天比较，#P＜0.05。

组别对照组模型组补肾活血汤组n 55 5造模第1 天18.53±0.31 18.55±0.46 18.32±0.56干预第14 天20.79±0.69#16.98±0.24△△#19.15±0.42△△**#

3.2.2 胫骨组织HE 染色结果 对照组骨组织完整，骨小梁排列规整，骨皮质未见明显缺失，骨髓腔内细胞散在分布无聚集，无明显炎性浸润。 与对照组相比，模型组、补肾活血汤组细胞增生显著，有明显骨转移征象，均可见不同程度骨质破坏、肿瘤细胞浸润、骨髓腔细胞呈簇状或片状聚集分布、核大深染、炎性浸润、细胞形态欠规则。与模型组相比，补肾活血汤组肿瘤细胞浸润、骨皮质毛燥等情况明显好转。 详见图4。

图4 胫骨组织HE 染色（×200）

3.2.3 裸鼠胫骨微CT 检查结果 由微CT 摄图（图5A）及胫骨骨破坏面积百分比分析（图5B）可见，对照组骨密度正常，未见明显骨缺损；与对照组比较，模型组骨破坏面积比显著增加（P＜0.01）、骨密度下降，有明显“蚀骨”征，尤以造模时注射4T1-luc 细胞处为甚；与模型组相比，补肾活血汤组骨破坏面积比明显降低（P＜0.05）。

3.2.4 裸鼠胫骨X 线检查结果 由各组裸鼠X 线检测照片可见（图5C），对照组裸鼠胫骨骨质连接完整，未见骨缺损；与对照组相比，模型组、补肾活血汤组可见不同程度骨皮质毛糙欠规则欠连续、密度降低、关节变形，其中模型组骨破坏程度最明显；与模型组相比，补肾活血汤组乳腺癌骨转移骨缺损程度明显好转。

图5 胫骨微CT、X 线检测及骨破坏面积百分比

3.2.5 胫骨组织切片Trap 染色结果 各组切片可见数量不等的红染Trap（+）细胞（图6）。与对照组相比，模型组骨基质边缘Trap（+）细胞数量显著增加（P＜0.01），多个细胞核聚集明显；与模型组相比，补肾活血汤组Trap（+）细胞数量减少（P＜0.05）且形态变小，无明显核聚集，红染变淡。

图6 胫骨组织Trap 染色（400×）及Trap 染色阳性细胞数目柱状图

3.2.6 胫骨组 织中SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表达结果 免疫组化法（图7、表3）与Western blot 法（图8）两种检测方法显示，模型组SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 基因表达水平显著高于对照组（P＜0.05）；与模型组相比较，补肾活血汤组SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 基因表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

图7 免疫组化法检测各组SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表达水平(×400)

图8 Western blot 法检测各组SRC、VEGF、MMP1 蛋白表达水平

4 讨论

乳腺癌骨转移是由肿瘤细胞突破原发灶基膜，侵犯周围基质与脉管系统，到达转移组织或靶器官，并从循环系统中逃逸出来定植于此，形成转移灶[10]。乳腺癌骨转移多为溶骨性病变，主要是肿瘤细胞与骨细胞之间相互串扰产生的结果[11]。正常情况下骨形成与骨吸收处于平衡状态[12]，骨转移发生时，肿瘤细胞产生的细胞因子和生长因子如甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related peptide, PTHrP）、IL-6 等刺激成骨细胞产生核因子κB 配体受体激活因子（receptor or activator of NF-κB ligand, RANKL），RANKL 促进破骨细胞形成进而产生溶骨效应[13]；反过来，骨吸收过程中释放的生长因子又促进肿瘤细胞生长，如血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子等，形成了一个“恶性循环”[14]，可见，破骨细胞的骨吸收作用是乳腺癌骨转移中的一个重要环节。

中医学认为，乳腺癌骨转移病属于“骨瘤”“骨蚀”“胫阴疽”等范畴[15]，肾主骨生髓，肾虚精亏，骨髓不充则利于癌邪侵犯骨骼。 《灵枢·本藏》中记载：“血和则经脉流行，营复阴阳，筋骨劲强，关节清利矣。 ”血液往来流利是骨骼强健的保证。 补肾活血汤[16]由熟地黄、杜仲、枸杞子、补骨脂、菟丝子、当归尾、没药、山茱萸、红花、独活、肉苁蓉组成，全方共奏补肾活血、通络止痛的功效。现代研究表明，补肾活血汤能改善骨质丢失、骨折，抑制破骨细胞活化[17-19]，方中红花、补骨脂、枸杞子、没药等多种中药均具有抗肿瘤活性[20-24]，该方在治疗乳腺癌骨转移中颇有疗效[8-9]。

本研究通过网络药理学，挖掘补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移的作用机制，并对所得结果进行实验验证。 共获得补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移的活性成分235 个、潜在靶点949 个、相关通路179 个。 拓扑算法分析筛定15 个核心靶点（Src、TP53 等）。 其中Degree、Closeness 度值排名第一的核心靶点均为Src，说明其可能是补肾活血汤治疗乳腺癌骨转移的关键靶点，选其为验证对象。 Src 是Src 家族激酶中的核心家族成员[25]，参与细胞增殖、分化、迁移等过程[26]，亦对破骨细胞的调控至关重要，抑制Src 活性会抑制破骨细胞形成，阻止破骨细胞前体从成骨细胞层迁移到骨表面，阻止再吸收坑的形成[27]。 VEGF是Src 重要的下游靶点[28-29]，VEGF 诱导可以提高裸鼠骨髓破骨细胞前体的存活率、分化能力和骨吸收活性[30]，因此，Src/VEGF 信号通路在骨转移疾病中发挥重要作用。 MMP1 与NFATc1 是该通路下游靶基因[31-32]，MMP1 与原发灶上皮-间充质转换密切相关[33]；且沉默MMP1 显著减少骨转移灶中破骨细胞数量[34-35]。 NFATc1 是调控破骨细胞的终末开关，抑制RANKL、异位表达NFATc1 的破骨细胞前体仍可分化为破骨细胞；破坏小鼠造血细胞中NFATc1 表达将诱导小鼠骨量增加和破骨细胞减少[36-37]。

实验表明，与对照组相比，模型组裸鼠体质量减轻（P＜0.01）；胫骨组织切片可见大量肿瘤细胞和炎性细胞浸润；胫骨骨破坏面积百分比显著增加（P＜0.01）；破骨细胞数量明显增加（P＜0.01）；胫骨组织SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表达水平显著升高（P＜0.01）。 与模型组相比，补肾活血汤组裸鼠体质量显著增加（P＜0.01）；肿瘤细胞和炎性细胞浸润情况好转；胫骨骨破坏面积百分比降低（P＜0.05）；破骨细胞数量减少（P＜0.05）；SRC、VEGF、MMP1、NFATc1 表达水平显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。 因此，补肾活血汤可能通过抑制Src/VEGF 轴及下游MMP1、NFATc1表达进而发挥治疗乳腺癌骨转移的作用。

综上所述，本研究通过对网络药理学预测结果进行验证，明确了补肾活血汤可能通过下调Src/VEGF轴及其下游MMP1、NFATc1 基因的表达发挥抑制乳腺癌骨转移疾病进展的作用。