2 型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病肝细胞损伤模型的建立及探讨

勾阳阳，曾广娴，喻 嵘*，陈 聪*

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.黔西南州中医院，贵州 兴义 562400；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是2 型糖尿病（type 2 diabetes, T2DM）的常见并发症之一，二者相互影响，呈恶性促进[1-3]。高糖、高脂的过度摄入，使人体的碳水化合物、脂质等物质发生代谢紊乱，是导致T2DM 合并NAFLD发病的主要原因。 中医学认为“毒损肝络”病机在T2DM 合并NAFLD 发展过程中贯穿始终。前期研究也发现，T2DM 合并NAFLD 的中医病机为气阴两虚、痰瘀互结、毒损肝络[1-2]。 现代医家普遍认为，“毒邪”泛指所有较甚的致病邪气，其中包括六淫之邪较盛或较久的外毒、 体内代谢产物蓄积蕴结而生的内毒[4-5]。 “肝络”是中医络病理论运用于内伤杂病辨治的体现，“毒损肝络”是指毒邪久伤肝络，引起肝脏出现痰凝津滞、气血瘀滞，以致气机升降失调，营卫不和，肝络失养的病变过程。 在T2DM 合并NAFLD 的发病中，“肥甘之味”被认为是损伤“肝络”的主要因素[6-8]。 根据病机，采用滋阴益气、活血解毒法治疗，发现可有效改善糖尿病MKR 鼠的血糖、血脂、肝功能[1-2]。 本课题组通过建立T2DM 合并NAFLD 的体外肝细胞损伤模型，改变肝细胞培养的微环境，模拟机体高糖、高脂环境下，肝细胞之间营养物质和代谢产物交换的过程，使其形成“毒损肝络”的状态，进一步探讨肝细胞损伤的机制，以期为中医药的治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞

正常大鼠肝细胞系，购于上海中乔新舟生物科技有限公司（NO.ZQ0078），培养基：10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、90% DMEM 培养基培养（1 mL 抗生素，含100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 链霉素）；培养箱环境：5% CO2，37 ℃。 培养液2～3 d更换1 次，显微镜下观察细胞生长密度达85%～95%传代。 实验场地由贵州中医药大学基础医学院教学实验中心提供。

1.2 主要试剂

DMEM 高糖培养基（美国Hyclone 公司，批号319005121）、胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号18050302）。

1.3 主要仪器

CO2培养箱（赛默飞世尔科技，thermo scientific midi40）；超净工作台（苏州智净，SW-CJ-2G 型）。

2 方法

2.1 肝细胞形态学观察

制备密度为1×105/mL 的细胞悬液，在6 孔板孔中，每孔加入1 mL 细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2培养箱。 培养24 h 后取出培养板，弃培养液，加入4%多聚甲醛固定约30 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）洗3 次。 加入苏木素染色液染核，1 min 后弃染色液PBS 洗5 次，于倒置光学显微镜下观察。

2.2 肝细胞鉴定

调细胞密度为1×105/mL 的细胞悬液，6 孔板（放入爬片）加入1 mL 细胞悬液，放入37 ℃，5%CO2培养箱。培养24 h 后取出培养板，弃原培养液，PBS 洗2 次，加入4%多聚甲醛固定约30 min，PBS洗3 次，每次5 min。 滴加100 μL 1% Triton 至爬片孵育2 min，PBS 洗3 次，每次5 min；加入100 μL 5%牛血清白蛋白，室温孵育30 min。 弃牛血清白蛋白，加入CK18 一抗（1∶100 用PBS 稀释），放置4 ℃过夜。 加入PBS 洗3 次，每次5 min。 避光加入配置好的荧光二抗工作液，37 ℃孵育40 min，PBS 洗3次，每次5 min。 滴加100 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚工作液复染细胞核，室温孵育4 min，PBS洗3次，每次5 min。 滴加一滴防淬灭荧光封片剂封片。激光共聚焦荧光显微镜下观察、拍片。

2.3 肝细胞损伤模型建立

调5×104/mL 的细胞悬液，接种于96 孔板，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h。 用不含FBS 的DMEM 基础培养液撤血清培养6 h 后进行分组，正常组通过完全培养基培养，高糖（high glucose,HG）组通过在完全培养基基础上加入葡萄糖注射液，调D-葡萄糖终浓度为30、50、100、150、200 mmol/L；油酸（oleic acid, OA）组通过在完全培养基基础上加入油酸溶液，终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L；再通过HG 5 个浓度组与OA 5 个浓度组排列组合，分设25 个联合刺激组。 每个浓度设6 个复孔、5个干预时间点，每组均设调零孔加入培养基及干预药物，不加细胞。 在培养12、24、36、48、60 h，分别取出培养板，每孔避光条件下加入CCK8 液10 μL，放入37 ℃、5% CO2培养箱继续避光孵育2 h，酶标仪450 nm 波长测各孔的OD 值，重复实验3 次，取均值。 计算抑制率：抑制率=[（正常组OD 值-调零孔）-（实验组OD 值-调零孔）]/（正常组OD 值-调零孔）。

2.4 油红O 染色法

调细胞密度为1×105/mL 的细胞悬液，接种于6孔板，每孔1 mL，培养24 h 后取出培养板，撤血清同步化处理6 h，弃培养液，PBS 洗涤2 次，分为：正常组、HG 组（100 mmol/L D-葡萄糖）、OA 组（0.2 mmol/L OA）、HG+OA 组（100 mmol/L D-葡萄糖+0.2 mmol/L OA），每孔分别加入1 mL 对应造模浓度的培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。取出培养板，弃培养基，PBS洗涤2次， 加入细胞样品固定液25 min，弃固定液，PBS 洗3 次。 加入油红O 染色液，密闭染色15 min，弃染色液，PBS 洗5 次。加入Mayer 苏木素染色液复染核1 min， 弃染色液，PBS洗5 次。 加入oro buffer 1 min，弃去后晾干。 于倒置光学显微镜下观察、拍片。

2.5 生化指标测定

分组及干预同“2.4”。每孔分别加入1mL 对应造模浓度的培养基，放入37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h。 取出培养板，收集培养液离心（3000 r/min，20 min）。 收集细胞，加入PBS 分别调整每组细胞密度为1.5×106/mL，超声粉碎细胞，离心（3000 r/min，20 min）收集上清。在全自动生化分析仪上设置相应参数，分别检测细胞上清液中谷丙转氨酶（alanine transaminase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）含量；细胞沉淀裂解后上清液中甘油三酯（triglyceride, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TC）含量。

2.6 肝细胞CK8、CK18 蛋白检测

分组及干预同“2.4”。 每孔分别加入1 mL 对应造模浓度的培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。 收集细胞后提总蛋白，蛋白定量，加入上样缓冲液后变性。 取10 μg 蛋白，SDS-PAGE 凝胶电泳后转膜，采用5%脱脂牛奶，封闭1 h；去封闭液后，稀释一抗，4 ℃孵育过夜。 TBST 洗3 次，5 min/次。稀释二抗（按照说明书），用二抗稀释液室温孵育膜1 h，用TBST 洗3 次，5 min/次。 采用增强化学发光液（enhanced chemiluminescence, ECL）化学法显影，在全自动化学发光分析仪中拍照，读取数据，采用β-actin 作为内参校正。

2.7 肝细胞培养上清中炎症因子含量测定

分组及干预同“2.4”。 每孔分别加入1 mL 对应造模浓度的培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。 收集上清液，离心（3000 r/min，5 min）后取上清，避光条件下取出试剂盒中酶标板，按照酶联免疫试剂盒说明书检测肝细胞上清液中炎症因子含量。重复实验3 次，取均值，根据每个指标标准品浓度绘制标准曲线，依据样本OD 值及稀释倍数，对照标准曲线，计算每孔样本的实际浓度。

2.8 统计学处理

采用SPSS 26.0 统计软件，数据满足正态性和方差齐性检验，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），结果以“±s”表示。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肝细胞的鉴定

细胞形态：生长状态良好的肝细胞直径约20 μm，为多边形，细胞核大而圆，位于细胞正中，部分细胞可以见到双核；分化较好的细胞体伸出明显的树枝样突起连接相邻细胞，生长到融合状态时，呈铺路石样外观。 免疫荧光染色：细胞核呈蓝色荧光，CK18蛋白阳性表达呈红色荧光。 详见图1。

图1 肝细胞形态及CK18 蛋白表达（免疫荧光，×400）

3.2 各组肝细胞增殖抑制率的比较

与正常组相比，当D-葡萄糖终浓度为150 mmol/L 时，肝细胞增殖开始出现抑制（P＜0.01）；当D-葡萄糖终浓度为200 mmol/L 时，各时间点肝细胞增殖受到显著抑制（P＜0.01）。0.1 mmol/L OA 刺激肝细胞36、48、60 h 与0.2 mmol/L OA 刺激肝细胞24、36、48、60 h 同0.3、0.4、0.5 mmol/L 各时间点刺激肝细胞OD值与正常组对比明显下降（P＜0.01 或P＜0.05），且肝细胞增殖抑制率随OA 浓度增加及刺激时间延长呈上升趋势。 肝细胞经HG 联合OA 刺激，30 mmol/L HG+0.1 mmol/L OA 刺激12 h，50 mmol/L HG+0.1 mmol/L OA刺激12 h、24 h、36 h，50 mmol/L HG+0.2 mmol/L OA 刺激12 h 均未出现抑制作用，其余各组联合浓度刺激均表现出明显抑制作用（P＜0.01），经100 mmol/L HG 联合0.2 mmol/L OA 刺激肝细胞24 h 后，细胞增殖抑制率接近半数抑制浓度。 见表1～3。

表1 不同浓度HG 对细胞增殖OD 值的影响（±s，n=6）

表1 不同浓度HG 对细胞增殖OD 值的影响（±s，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01。

分组正常组30 mmol/L HG 组50 mmol/L HG 组100 mmol/L HG 组150 mmol/L HG 组200 mmol/L HG 组12 h 0.81±0.01 0.92±0.03**1.03±0.06**0.99±0.08**0.77±0.02**0.31±0.01**24 h 1.07±0.05 1.49±0.02**1.64±0.05**1.43±0.03**0.87±0.03**0.24±0.01**36 h 1.19±0.01 1.92±0.02**1.96±0.05**2.19±0.03**0.95±0.02**0.40±0.02**48 h 1.34±0.03 1.74±0.04**2.02±0.06**2.23±0.01**1.05±0.04**0.22±0.02**60 h 1.56±0.03 2.44±0.04**2.48±0.02**2.77±0.02**1.25±0.02**0.61±0.02**

表2 不同浓度OA 对细胞增殖OD 值的影响（±s，n=6）

表2 不同浓度OA 对细胞增殖OD 值的影响（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

分组正常组0.1 mmol/L OA 组0.2 mmol/L OA 组0.3 mmol/L OA 组0.4 mmol/L OA 组0.5 mmol/L OA 组12 h 0.81±0.01 1.04±0.06**1.05±0.05**0.62±0.02**0.42±0.02**0.22±0.02**24 h 1.07±0.05 1.08±0.03 1.00±0.06**0.36±0.03**0.32±0.02**0.21±0.01**36 h 1.19±0.01 1.14±0.02*1.02±0.05**0.35±0.03**0.21±0.04**0.20±0.02**48 h 1.34±0.03 1.17±0.07**1.05±0.03**0.18±0.001**0.17±0.004**0.19±0.01**60 h 1.56±0.03 1.32±0.07**1.22±0.01**0.25±0.04**0.18±0.02**0.2±0.01**

表3 HG 联合OA 对肝细胞增殖抑制率的影响（n=6）

3.3 各组肝细胞内脂滴的比较

与正常组相比，油红O 染色显示，肝细胞经100 mmol/L HG 组刺激24 h 后，细胞质内开始出现少量脂滴；经0.2 mmol/L OA 组刺激24 h 后，细胞内脂滴明显多于正常组和HG 组；经100 mmol/L HG联合0.2 mmol/L OA 刺激24 h 后，HG+OA 组细胞内脂滴出现大量蓄积，均多于正常组、HG 组及OA 组。详见图2。

图2 肝细胞脂肪变性（油红O 染色，×400）

3.4 各组肝细胞ALT、AST、TG、TC 含量的比较

与 正 常 组 相 比，HG 组、OA 组 及HG+OA 组ALT、AST、TG、TC 指标均升高（P＜0.01 及P＜0.05）。与HG 组、OA 组比较，HG+OA 组ALT、AST、TC 指标均显著高于HG 组（P＜0.01 及P＜0.05）。详见表4。

表4 各组肝细胞生化指标（±s，n=6）

表4 各组肝细胞生化指标（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与HG 组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与OA 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别正常组HG 组OA 组HG+OA 组ALT/（U/L）25.11±0.92 29.42±2.64*34.97±0.62**41.54±1.50**▲▲△△AST/（U/L）22.24±1.46 29.28±1.24**30.04±1.57**38.18±1.53**▲▲△△TG/（mmol/L）0.39±0.02 0.44±0.01**0.43±0.03*0.48±0.01**△TC/（mmol/L）0.59±0.04 0.75±0.08**0.70±0.05*0.86±0.02**▲△△

3.5 各组肝细胞内CK8、CK18 蛋白的比较

与正常组相比，HG 组、OA 组及HG+OA 组细胞内CK8、CK18 蛋白表达均增加（P＜0.01）；与HG 组比较，HG+OA 组细胞内CK8、CK18 蛋白表达均显著高于HG 组（P＜0.01）；与OA 组比较，HG+OA 组细胞内CK8、CK18 蛋白表达均显著高于OA 组（P＜0.01及P＜0.05）。 详见表5、图3。

图3 各组肝细胞内CK8、CK18 蛋白相对表达量

表5 各组肝细胞内CK8、CK18 蛋白相对表达量（±s，n=6）

表5 各组肝细胞内CK8、CK18 蛋白相对表达量（±s，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与HG 组比较，▲▲P＜0.01；与OA 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别正常组HG 组OA 组HG+OA 组CK8/β-Actin 0.06±0.04 0.53±0.08**0.70±0.04**0.80±0.03**▲▲△CK18/β-Actin 0.06±0.02 0.09±0.01 0.13±0.03**0.20±0.01**▲▲△△

3.6 各组肝细胞上清中NLRP-3、Caspase-1、IL-1β含量的比较

与正常组相比，HG 组和HG+OA 组细胞培养上清中炎症因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量均增加（P＜0.01 及P＜0.05）。 与HG 组比较，HG+OA 组细胞培养上清中炎症因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β含量均显著升高（P＜0.01）。 与OA 组比较，HG+OA组细胞培养上清中炎症因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量均显著升高（P＜0.01）。 详见表6。

表6 各模型组肝细胞培养上清NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量（±s，n=6）

表6 各模型组肝细胞培养上清NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量（±s，n=6）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与HG 组比较，▲▲P＜0.01；与OA 组比较，△△P＜0.01。

NLRP-3/（ng/mL）18.42±0.91 19.78±0.26*19.40±0.13 21.65±0.52**▲▲△△Caspase-1/（pmol/L）29.83±0.23 34.59±0.42**35.82±0.84**41.02±1.75**▲▲△△IL-1β/（pg/mL）36.10±0.33 39.77±1.37**41.87±0.07**47.86±0.56**▲▲△△组别正常组HG 组OA 组HG+OA 组

4 讨论

《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 更新版）》中指出，NAFLD 的诊断除病理学影像学发现肝组织脂肪变性外，肝脏生物化学指标异常是主要诊断依据，其中包括血清氨基酸转移酶和（或）TG 的持续增高。 该指南中还指出，当NAFLD 合并T2DM 时，血清氨基酸转移酶和（或）CK-18 的持续增高的患者是诊断NASH 的高危人群[9]。 本实验通过油红O 染色及细胞生化检测发现，HG 联合OA 诱导的肝细胞脂滴蓄积以及TG、TC 指标均显著高于正常培养的肝细胞，同时HG 联合OA 诱导肝细胞后，细胞培养上清中的ALT、AST 含量显著高于正常组。提示肝细胞出现脂肪变性，肝细胞功能受损。通过检测细胞培养上清中的NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 炎症因子含量，发现HG 联合OA 诱导肝细胞后，细胞培养上清中的相关炎症因子含量显著高于正常组，提示诱导后的细胞中NLRP-3 相关炎症信号通路被过度激活，肝细胞内产生炎症反应。 有研究发现CK8 以及CK18 的异常，与癌症及肝脏的损伤程度呈正相关[10-11]。通过检测肝细胞内的CK8、CK18 蛋白的表达发现，HG 联合OA 组的CK8、CK18 蛋白表达较正常组均显著升高，进一步说明HG 联合OA 可诱导肝细胞发生损伤。 相比单纯HG 或OA 刺激，HG 联合OA 诱导肝细胞损伤更显著，提示T2DM 合并NAFLD 体外细胞损伤模型成功建立。

研究认为肝脏中的微循环是“肝络”的基本构成[12]。南征教授团队通过实验发现，“毒损肝络”的现代病理机制是肝内炎症反应[13]。通过文献研究发现，“毒损肝络”病机在T2DM 合并NAFLD 发展过程贯穿始终，其中的“毒”既是病理产物，又是致病因素，这与细胞炎症因子的作用轨迹具有相似性[14-16]。 “毒”在机体代谢中均存在恶性循环。清代医家叶天士言：“经主气，络主血”，“初为气结在经，久则血伤入络”（《临证指南医案》），体现了邪毒致病从无形到有形的过程[17-19]。 基于吴以岭教授团队近年来总结前人经验提出的“络脉—微血管”论[20]，结合肝脏微循环的生理功能，本实验在建立T2DM 合并NAFLD 的体外细胞损伤模型时，通过改变肝细胞培养的微环境，模拟机体高糖、高脂环境下，肝脏微循环与肝细胞之间营养物质和代谢产物交换的过程，制备“毒损肝络”细胞损伤模型。 当100 mmol/L HG 联合0.2 mmol/L OA 诱导肝细胞24 h 培养条件下，肝细胞增殖出现半数抑制，肝功能出现明显改变，肝细胞脂肪变性、炎症反应和细胞损伤程度远高于HG 组合OA 组，提示高糖高脂环境改变肝脏微循环条件，相当于疾病久积“血伤入络”的状态。

中医学认为T2DM 合并NAFLD 的主要病因之一为过食“肥”“甘”，本实验基于中医理论及前期研究认识，运用HG 联合OA 模拟病因，制造“毒损肝络”的状态，再依据T2DM 合并NAFLD 病机演变，早期（脾气亏虚）、中期（湿热内蕴）、后期（肝肾阴虚、痰瘀互结），发现本实验模型组肝细胞内脂质大量蓄积，肝细胞功能受损，出现了形质和功能的同时改变。 此时的肝细胞更接近于T2DM 合并NAFLD 中后期的改变，细胞内产生有形实邪的蓄积和相互搏结。 同时，肝细胞内炎症因子NLRP-3、Caspase-1、IL-1β 含量均升高，提示“毒损肝络”状态下存在肝内炎症的发生，且其发生的物质基础可能与NLRP-3 炎性小体及其下游炎性分子的过度活化有关。 因此，针对脾气亏虚、湿热内蕴、肝肾阴虚、痰瘀互结导致“毒损肝络”病机，可采用滋阴益气活血解毒法，使得肝细胞内外炎性微环境得到改善，则肝络疏达；肝细胞功能得到改善，则肝体得养；同时肝细胞内脂质蓄积含量明显减少，则肝积得化；从而从根本上达到改善肝细胞损伤的目的。