Necroptosis 抑制剂及相关病症的研究进展

易宏婷，曾宣铭，张玉珂，颜蓉，雷彬，陈钟文，刘华

（江西中医药大学药学院，江西南昌，330004）

0 引言

Necroptosis 称为程序性细胞坏死或坏死性凋亡，是先由受体相互作用蛋白激酶1/3（Receptor-Interacting Protein Kinase 1/3，RIPK1/3）发动，再由下游的混合谱系激酶结构域样蛋白（Mixed Lineage Kinase Domain-Like Protein，MLKL）来执行的一种细胞死亡方式［1］。其中，RIPK1/3 是necroptosis 的关键酶，受caspase 通路和泛素化调控［2］。RIPK1 是促生存的NF-κB 信号通路与肿瘤坏死因子TNF 信号通路响应的细胞死亡之间的细胞决策关键调节因子。RIPK3通过其独特的C 端段与RIPK1 的结合，抑制RIPK1 和TNFR1 介导的NF-kB 激活；MLKL 被鉴定为RIPK3的下游靶点和necroptosis 的最终执行器［3］。RIPK3 和MLKL 的表达都是诱导necroptosis 的必要条件。该文主要从与necroptosis 相关的疾病和necroptosis 两类主要的抑制剂进行综述，期望为中医药类necroptosis 抑制剂的科学研究和临床提供参考。

1 necroptosis 与疾病

1.1 肿瘤

研究表明，necroptosis 相关激酶 RIPK1、RIPK3和 MLKL 与放射治疗（放疗）后的肿瘤再增殖息息相关［4］。

RIPK1 能通过NF-κB 依赖途径促进黑色素瘤细胞增殖，并且能够延缓黑色素瘤异种移植在体内的生长，抑制黑色素瘤细胞在体外增殖［10］。RIPK3 与MLKL 的表达在癌症中发挥抗炎和抗肿瘤的作用。乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、 慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肺癌和黑素瘤、胶质瘤、鼻咽癌、骨髓瘤和淋巴瘤等癌症患者的样本中RIPK3 表达降低［6，7］。在携带突变急性髓系白血病驱动基因的骨髓细胞移植的小鼠中，敲除RIPK3 后，白血病发生明显加快，RIPK3敲除小鼠的存活率也低于野生型小鼠。并且，RIPK3敲除小鼠发生结肠炎相关结直肠癌的风险更高，并产生了更多的促炎或促肿瘤因子［8］。同样，RIPK3 低表达提示乳腺癌患者预后较差［6］。而敲除MLKL 可防止肿瘤细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等多种细胞类型的坏死［5］。MLKL 的不正常表达亦会对诸多癌症造成影响，其若表达偏低会导致胃癌、食管癌、卵巢癌和结肠癌的预后不良，其若表达偏高则会影响宫颈鳞癌的总体存活率的改善［6］。

1.2 炎症性疾病

细胞发生necroptosis 会导致细胞膜破裂，细胞质内容物流出，引发炎症反应，炎症反应又会导致necroptosis。关节炎、败血症、急性胰腺炎、肠炎和肺炎等都是与necroptosis 相关的炎症性疾病［10］。研究表明，促炎症细胞因子的合成和释放使得程序性细胞坏死的细胞可以调控炎症反应的发生［16］，这为治疗炎症性疾病提供了新的思路。

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以累及周围关节为主的慢性、系统性和炎症性自身免疫性疾病。慢性增生性滑膜炎是导致RA 的基本病理改变以及关节破坏的罪魁祸首。文献报道［9］，胶原诱导性关节炎鼠关节滑膜中程序性细胞坏死的标志性蛋白p-MLKL 的表达水平明显升高。此外，RA 关节滑膜中p-MLKL 和MLKL 的表达水平显著增高［9］，p-MLKL 在诱导坏死中显著增加14-3-3η 蛋白的释放［11］。此外，p-MLKL 的表达水平与红细胞沉降率、Krenn 总分及衬里下层炎性细胞浸润亚分呈正相关。RA 患者关节中的中性粒细胞在跨膜黏附糖蛋白CD44 和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的影响下激活RIPK1、RIPK3 和MLKL，引起程序性细胞坏死，此时可通过应用成纤维细胞激活蛋白-α（FAP-α）来阻止坏死［12］，这突出了FAP-α 作为治疗RA 有效药物的重要性。

RIPK3 依赖型necroptosis 亦能促成慢性炎性疾病。例如在Ripk3-/-、ApoE-/-和Ldl-/-的动脉粥样硬化动物模型的斑块中的坏死巨噬细胞数量显著减少［9］。敲除 RIPK3 基因的小鼠能有效阻止肠炎的发生。RIPK1 与心脏缺血再灌注损伤有关［13］，而RIPK3 与心肌梗死诱导的心肌坏死和重塑有关。在RIPK1 缺失的情况下，RIP3 会诱导心肌细胞发生坏死［14］。此外，由RIPK3 引起的心肌坏死是通过CaMKII 的激活介导的，因此心肌细胞中RIPK3 依赖性的坏死与许多其他细胞类型的坏死明显不同，在其他细胞类型中它需要RIPK1 和MLKL［13］。这些发现揭示了一种以前未被重视的坏死模式，并为缺血和氧化应激诱导的心脏损伤、适应不良重构和心力衰竭提供了新的治疗靶点。

1.3 神经退行性疾病

帕金森病（Parkinson's disease，PD）、多发性硬化（Multiple Scalerosis，MS）、肌萎缩侧束硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）和阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）等神经退行性疾病的病理进程都受到 necroptosis 的影响［16］。

最新研究［13］表明TNF-α 可以通过RIPK1-FADD-Caspase-8 轴诱导星形胶质细胞凋亡，并通过RIPK3-MLKL 信号通路诱导神经元发生necroptosis，进而引起PD。PD 的病理性细胞死亡过程与RIPK1 磷酸化激活有关。在MS 发生发展过程中，促炎细胞因子——TNF- α，在caspase-8 缺乏的情况下，会激活 RIPK1 和RIPK3 介导的necroptosis 通路，引起神经元的退行性病变，诱导少突胶质细胞的变性死亡。此外，研究表明，在MS 病理的发生发展过程中，抑制RIPK1 可防止TNF-α 诱导的少突胶质细胞死亡，故而MS 可以采取靶向RIPK1 抑制剂的治疗。在 ALS病理发展过程中，RIPK1、RIPK3 和 MLKL 信号通路在脊髓神经组织内被激活，进而影响进行性运动神经元死亡和神经轴突的退化［16］。此外，随着脑内 RIPK/MLKL 信号通路活性的降低，AD 转基因动物脑内神经元死亡和认知功能也会降低［17］。

1.4 其他疾病

创伤性脑损伤（TBI）致残及死亡的元凶之一是大量细胞坏死。脑组织的损伤及功能障碍与necroptosis密切相关。研究表明，通过诱导致死性氧化应激来活化Akt/mTOR 会导致神经元necroptosis，抑制necroptosis 有可能为TBI 提供一种新的治疗策略。此外，necroptosis 还是脑血管疾病，例如脑缺血、再灌注损伤的重要死亡途径；缺血性脑损伤与细胞内凋亡信号缺乏导致necroptosis 诱导产生有关［18］。

除此之外，necroptosis 还参与到病毒、细菌和寄生虫等病原微生物感染，以及肾脏、肝脏和免疫性等疾病的病程中，会加重细胞或组织损伤［10］。

2 necroptosis 的抑制剂

necroptosis 既能促进某些疾病的发生，又能成为治疗肿瘤的潜在方式。因此，necroptosis 的诱导剂和抑制剂的研究是一场具有重大意义的持久战。necroptosis 抑制剂针对作用靶点的不同，分为RIPK1 抑制剂、RIPK3 抑制剂和 MLKL 抑制剂。PIPK1 抑制剂有Nec-1、Nec-1s、Nec-3、Nec-4、Nec-5、 GSK963、TAK-632、B31j；RIPK3 抑制剂有Dabrafenib、GSK840、GSK843、GSK872、HS-1371、KongensinA、TAK-632、B31j、C1m；MLKL抑制剂有Necrosulfonamide（NSA）、Thioredoxin-1、TC13172、GW806742X［7，33］。 其中，Nec-1 和NSA是研究较为深入的两种。

2.1 特异性抑制剂Nec-1

Nec-1 是一种小分子生物碱，是首个被发现的necroptosis 特异性小分子抑制剂。Nec-1 不仅能阻止程序性细胞坏死，也能抑制细胞凋亡［19］。

Nec-1 能显著缩小心肌梗死的梗死面积，并通过抑制 RIPK1 的表达减少心肌细胞丢失，来保护心肌、改善心肌重构和心脏功能［21，24］；还能改善脑水肿、减少颅内损伤以及提高脑神经功能［22］；也能缓解急性肝衰竭、急性肾衰竭和缺血再灌注等的疾病进展，提高生存期和疾病预后［7］。

此外，研究表明，Nec-1 能显著抑制 ROS 的生成［23］；还能提高因缺氧引起的细胞损伤的细胞活性，也能缓解急性肝衰竭小鼠模型线粒体功能障碍，并抑制 ROS 生成及其对细胞的损伤［24，25］。尽管Nec-1对诸多疾病具有抑制作用，但因其半衰期很短 （t1/2<5 min），造成其成药性较差。研究继而发现Nec-1s 具有较好的活性，且其半衰期也有明显提升［26］，这便为RIPK1 抑制剂的进一步研究提供了新思路。

2.2 necroptosis 抑制剂NSA

NSA 是由美国科学院院士王晓东教授的团队通过建模抑制人结肠癌细胞HT-29 死亡，筛选20 万个化合物得到的一种MLKL 小分子抑制剂，证明NSA 可以有效防止HT-29 的necroptosis［27］。

NSA 具有物种特异性。Sun L 等人［28］研究发现，人类MLKL 中被NSA 共价修饰的半胱氨残基cys86 在小鼠MLKL 中被色氨酸残基所取代，导致NSA 具有物种特异性，其能有效阻断人类细胞的坏死，但不能阻断小鼠细胞的坏死。

单独处理的NSA 虽然能显著增强Caspase 抑制剂（z-VAD.fmk）对小分子Smac 模拟物（BV6）或去甲基化剂（5AC）诱导的细胞死亡的保护作用，但不能阻止细胞死亡。此外，NSA 与 MLKL 基因在诱导necroptosis 的情况下被敲减，也均能使管状线粒体保持正常形态［29］。 当存在NSA 时，仅能观察到离散的RIPK3，故而NSA 可以通过作用于坏死的特定途径，来阻止necroptosis［30］。另外，NSA 可以抑制髓核（NP）细胞凋亡和necroptosis 来预防NP 降解［31］，还可以抑制NCM460 细胞磷酸化MLKL 的表达和necroptosis，最终缓解肠道炎症等［31］。

最新研究发现，NSA 在啮齿动物神经系统疾病模型中具有治疗窗口期，除了抑制MLKL 活性外，还能通过提高脊髓损伤小鼠模型的抗氧化能力来改善神经功能损伤，减轻AD 大鼠模型中的淀粉样变性和牛头病变［32］。此外，NSA 通过诱导MLKL 泛素化和降解，在小鼠缺血性脑损伤后表现出神经保护作用并通过抑制炎症和坏死来减轻小鼠脑出血模型的急性脑损伤［33］，对在帕金森病（PD）亚急性MPTP 小鼠模型中类似PD 的行为缺陷和病理生理，如坏死、神经炎症和α-突触核蛋白寡聚化有治疗作用［34］。这些研究结果均为necroptosis 在疾病发病机制中发挥作用增加了证据。

靶向MLKL 的NSA 虽然在对necroptosis 的特异性上非常具有优势，但是对其构效关系的研究并没有得到活性提升的衍生化合物，因此难以作为药物开发的前提［35］。

综上，最具代表性的nec-1 和NSA 抑制剂均存在各自的不足，并未能上市成为necroptosis 抑制剂，而天然产物具有多种生理活性，包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎等，同时还具有副作用小、安全性高等优势，在药品、食品及日化等领域存在着巨大的开发潜力。最新研究表明，紫草中的紫草素不仅能诱导卵巢癌［36］、鼻咽癌［37］细胞与三阴性乳腺癌细胞［38］产生大量的活性氧、上调RIPK1 和RIPK3 蛋白的表达，以激活necroptosis 进程，明显抑制卵巢癌SKOV3 和A2780 细胞、鼻咽癌CNE2 和HNE2 细胞与三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 的增殖，还能抑制炎症并通过提高抗氧化能力发挥防治血热证的药理作用［39］，也能通过增加抗氧化酶基因表达及抑制ERK1/2-NFκB 信号通路改善T2DM 肝损伤［40］等。

3 总结与展望

2022 年9 月，世界卫生组织发布的报告显示，心脏病、癌症、糖尿病等非传染性疾病 （NCDs）已超过传染病，成为“全球头号杀手”，每两秒钟就有一名70 岁以下的人死于非传染性疾病，每年约占全球死亡人数的四分之三死于该类疾病。necroptosis 与非传染性疾病息息相关，近年来，与necroptosis 相关的研究成了一个广泛和迅速发展的领域。但从上市药物中筛选得到的抗necroptosis 抑制剂靶点不仅选择性较差，而且可能会引起大量不良反应。此外，迄今为止发现的各种抑制剂均存在成药性较差、分子量或毒性较大等问题，因此很难成药。天然产物正好能弥补现有抑制剂的不足，这不仅是对于成为necroptosis 抑制剂，还是对于中医药的发展都具有很深远的价值与意义。该综述查阅了近几年的相关文献，以necroptosis的主要通路—TNF-α-RIP1/3-MLKL 展开，将蛋白与疾病、抑制剂联系起来，旨在从已知突破未知，能够克服necroptosis 抑制剂的种种缺陷，为研发高效、高选择性、代谢稳定性好和低毒性的necroptosis 抑制剂提供参考。