miRNA-1246通过NF-κB介导乳腺癌细胞紫杉醇耐药的机制研究

王 新，左 文*，胡书群，周艳丽，韩 娇

0 引言

乳腺癌作为常见的恶性肿瘤，严重威胁着女性的身心健康[1]。目前，乳腺癌的主要治疗方法以手术、放射治疗和化学治疗为主，近年来，一些生物或免疫疗法也逐渐应用于临床[2-3]。但获得性耐药的出现往往导致化学或生物药物治疗失败。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是乳腺癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤的一线化疗药物，其通过促进微管聚合，使细胞周期阻滞于G2/M期，最终导致细胞凋亡[4]。由于PTX有着确切的疗效和安全性，自发现至今一直被临床广泛应用。但许多中晚期患者经过一定疗程的PTX治疗后易出现耐药现象。因此，解决PTX耐药具有重要的临床意义。

微小RNA(miRNA)是近年来的研究热点之一，miRNA能通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并指导降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译[5]。研究显示，miRNA在多种疾病的发生发展中发挥作用，如恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病等[6]。微小RNA-1246(miR-1246)是最近发现的一种miRNA，是多种恶性肿瘤，如乳腺癌[7]、胃癌[8]、前列腺癌[9]等的潜在诊断标志物。已有研究显示，miR-1246能够靶向 CyclinG2调控乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和化疗耐药[10]。但有关miR-1246与乳腺癌化疗耐药的报道还很有限，miR-1246的相关耐药机制还不明确，有待更多研究探讨。本研究通过构建PTX耐药乳腺癌细胞SK-BR-3/PTX，观察miR-1246在SK-BR-3/PTX中的作用和相关作用机制，为解决乳腺癌PTX耐药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和药物 人乳腺癌细胞SK-BR-3购自北纳生物；PTX(批号：1A00551)购自美国Sigma公司。

1.2 主要试剂和仪器 细胞计数试剂盒8(Cell counting kit-8，CCK-8)购自美国MedChemExpress公司； Annexin V/PI凋亡检测试剂盒、RIPA总蛋白提取试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒和GAPDH抗体购自北京索莱宝公司；RNAiso for Small RNA试剂盒、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒和引物购自北京宝日医生物；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、LaminB、P-gp一抗、抗兔IgG-HRP二抗及荧光二抗均购自美国CST公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)购自美国Gibco公司；miR-1246 inhibitor转染试剂盒购自上海吉凯基因公司。SpectraMax M5/M5e多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司，Leica DMi8倒置荧光显微镜购自德国Leica公司，ABI 7500型定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，Accuri C6 Plus流式细胞仪购自美国BD公司，E-Gel Imager凝胶成像系统购自美国Invitrogen公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养和耐药细胞诱导 SK-BR-3细胞培养于含10% FBS和1%青-链霉素的DMEM高糖培养基中，细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。PTX耐药SK-BR-3细胞(SK-BR-3/PTX)采用逐渐增加PTX药物浓度(0.1～500 nmol/L)方法诱导，经过4个月成功获得一株耐药细胞。

1.3.2 miR-1246 inhibitor转染 将miR-1246 inhibitor和对照 inhibitor(NC inhibitor)粉末用RNase-free water配制成20 μmol/L的母液备用。将对数期SK-BR-3/PTX细胞以5×105个/孔接种于6孔板。次日，配制分别含200 nmol/L miR-1246 inhibitor和NC inhibitor的DMEM高糖培养基，用DMEM高糖培养基稀释脂质体2000。将含inhibitor和脂质体2000的培养基混合，室温静置20 min。混合物分别加入细胞中，分别作为miR-1246 inhibitor组和NC inhibitor组，再加入1 ml DMEM高糖培养基继续培养24 h，以RT-qPCR对miR-1246表达进行验证。

1.3.3 CCK-8法检测细胞活力 将对数期SK-BR-3细胞和 SK-BR-3/PTX细胞按8×103个/孔分别接种于96孔板，每组5个重复孔，SK-BR-3细胞以0.1、1、10、100、1 000 nmol/L PTX处理48 h，SK-BR-3/PTX细胞以10、100、500、1 000、5 000、10 000 nmol/L PTX处理48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于培养箱3 h，酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞miR-1246表达 细胞以RNAiso for Small RNA试剂盒提取总Small RNA，参考说明书以Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit试剂盒和引物进行RT-qPCR反应。以U6作为内参，2(-△△Ct )法计算miR-1246表达水平。miR-1246正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAATGGATTTTTGG-3′；miR-1246反向引物：5′-ACTGACTGATGCAATCTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6正向引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′；U6反向引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.3.5 免疫荧光实验检测细胞P-gp表达 将盖玻片置于6孔板中，以5×105个/孔分别接种SK-BR-3细胞和 SK-BR-3/PTX细胞，24 h后PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，再以Triton X-100通透10 min。取出盖玻片，滴加含5%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭2 h。滴加P-gp抗体(1∶300)于4 ℃孵育过夜。PBST洗去一抗，滴加荧光二抗(1∶250)于黑盒内室温孵育1 h。洗去二抗，DAPI染色5 min，洗去DAPI，抗荧光猝灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.3.6 Western blot法检测p-NF-κB p65、IκBα和P-gp蛋白表达 用RIPA试剂盒提取细胞总蛋白，以核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白。提取的蛋白以增强型BCA蛋白定量试剂盒进行定量并制备蛋白上样样品。蛋白按25 μg/孔采用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离。进一步将凝胶上分离好的蛋白转印至PVDF膜。5% BSA封闭PVDF膜2 h，4 ℃孵育NF-κB p65(1∶2 000)、p-NF-κB p65(1∶800)、IκBα(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)、LaminB(1∶2 000)或P-gp(1∶2 000)抗体过夜。TBST 洗去一抗，室温避光孵育抗兔IgG-HRP二抗(1∶4 000)1 h，TBST 洗去二抗。PVDF膜表面淋SuperSignal化学发光液，于凝胶成像系统下成像。

1.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡 将NC inhibitor和miR-1246 inhibitor细胞以PTX(5 nmol/L)处理48 h，设为NC inhibitor+PTX组和miR-1246 inhibitor+PTX组；同时用1‰体积蓖麻油(PTX溶剂)处理NC inhibitor作为对照，设为NC inhibitor。PTX处理结束后，用Annexin V/PI试剂盒于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 miR-1246在SK-BR-3/PTX细胞中表达上调 CCK-8检测活力，经计算PTX对SK-BR-3细胞的IC50为(45.2±3.9)nmol/L，对SK-BR-3/PTX细胞的IC50为(2 317.6±188.6)nmol/L，SK-BR-3/PTX细胞耐药指数为51.3。与SK-BR-3细胞相比，PTX对SK-BR-3/PTX细胞的IC50显著升高(P<0.01，图1A)。RT-qPCR结果显示，与SK-BR-3细胞相比，SK-BR-3/PTX细胞miR-1246表达水平显著升高(P<0.01，图1B)。

图1 SK-BR-3/PTX细胞的构建及miR-1246表达水平检测

2.2 P-gp蛋白在SK-BR-3/PTX细胞中表达上调 Western blot结果显示，与SK-BR-3细胞相比，SK-BR-3/PTX细胞P-gp蛋白表达水平显著上调(P<0.01，图2A)。免疫荧光实验结果显示，SK-BR-3细胞和SK-BR-3/PTX细胞P-gp荧光染色的IOD值分别为(2 358.6±200.8)和(93 689.5±7 056.2)，与SK-BR-3细胞相比，SK-BR-3/PTX细胞P-gp荧光染色的IOD值显著升高(P<0.01，图2B)。

图2 SK-BR-3和SK-BR-3/PTX细胞P-gp蛋白表达情况

2.3 SK-BR-3/PTX细胞NF-κB通路活性增强 Western blot结果显示，与SK-BR-3细胞相比，SK-BR-3/PTX细胞总蛋白p-NF-κB p65蛋白显著上调，IκBα蛋白明显下调(P<0.01，图3)。在提取的细胞核蛋白中，与SK-BR-3细胞相比，SK-BR-3/PTX细胞NF-κB p65蛋白显著上调(P<0.01，图3)。

图3 SK-BR-3和SK-BR-3/PTX细胞NF-κB通路相关蛋白表达情况

2.4 miR-1246 inhibitor增强SK-BR-3/PTX细胞对PTX的敏感性 SK-BR-3/PTX细胞转染NC inhibitor和miR-1246 inhibitor后，miR-1246相对表达水平分别为(123.6%±9.6%)和(15.9%±2.1%)。与NC inhibitor组相比，miR-1246 inhibitor组相对表达水平显著降低(P<0.01，图4A)。流式细胞仪结果显示，NC inhibitor、NC inhibitor+PTX及miR-1246 inhibitor+PTX组的凋亡率分别为(5.1%±0.9%)、(16.6%±2.3%)、(41.1%±6.8%)。NC inhibitor+PTX组较NC inhibitor组细胞凋亡显著增加(P<0.01)；相较于NC inhibitor+PTX组，miR-1246 inhibitor+PTX组细胞凋亡明显增加(P<0.01，图4B)。

图4 抑制miR-1246影响SK-BR-3/PTX细胞对PTX的敏感性

2.5 miR-1246 inhibitor抑制SK-BR-3/PTX细胞NF-κB通路活化和P-gp蛋白表达 Western blot结果显示，与NC inhibitor组细胞相比，miR-1246 inhibitor组细胞总蛋白p-NF-κB p65和P-gp蛋白显著下调，IκBα蛋白明显上调(P<0.01，图5)。在提取的细胞核蛋白中，与NC inhibitor组细胞相比，miR-1246 inhibitor组细胞NF-κB p65蛋白显著下调(P<0.01，图5)。

图5 NC inhibitor和miR-1246 inhibitor组细胞各蛋白表达情况

3 讨论

本研究成功构建PTX耐药乳腺癌细胞SK-BR-3/PTX，耐药指数为51.3。值得注意的是，miR-1246在SK-BR-3/PTX中表达上调。提示miR-1246可能在PTX耐药中发挥一定作用。同时，本研究还发现，P-gp蛋白在SK-BR-3/PTX细胞中表达上调。P-gp属于ATP-结合盒转运体超家族成员，通常在人体血脑屏障、肠腔膜、近曲小管上皮细胞中高表达，能够将进入细胞的药物泵出胞外[11-12]。P-gp的底物主要是一些疏水亲脂性药物，如一些抗肿瘤药、抗心律失常药、激素类药物、钙拮抗药等。研究显示，P-gp诱导的细胞内药物外流、微管蛋白突变、微管蛋白同型抗原的增加等均可引起紫杉醇耐药[13]。本研究构建的SK-BR-3/PTX细胞对PTX耐药可能依赖于P-gp。

NF-κB是一种细胞核转录因子，因其能够与B细胞免疫球蛋白的κ轻链基因的增强子κB序列特异结合而得名[14]。研究已证实，NF-κB在乳腺癌细胞PTX耐药中发挥作用[15]。因此，本研究对NF-κB信号通路进行了观察。结果发现，p-NF-κB p65在SK-BR-3/PTX细胞总蛋白中上调，IκBα蛋白下调。而在核蛋白中，SK-BR-3/PTX细胞NF-κB p65蛋白上调。通常NF-κB p65与IκBα 蛋白结合并受到其抑制，IκBα表达下调可导致NF-κB p65磷酸化并进入细胞核[16]。研究已证实，NF-κB为P-gp上游调节靶点，可介导后者的表达[17]。上述结果提示，SK-BR-3/PTX细胞PTX耐药的维持可能与NF-κB通路活化，进而上调P-gp蛋白表达有关。但miR-1246是否在上述机制中发挥作用还有待于进一步研究。

本研究采用转染化学合成的miR-1246 inhibitor抑制SK-BR-3/PTX细胞miR-1246。进一步观察发现，miR-1246 inhibitor可显著增强SK-BR-3/PTX细胞对PTX的敏感性。提示miR-1246参与介导SK-BR-3/PTX细胞对PTX的耐药。分子水平上发现，miR-1246 inhibitor能抑制SK-BR-3/PTX细胞总蛋白中p-NF-κB p65和P-gp蛋白表达，并上调IκBα蛋白；同时，miR-1246 inhibitor还能抑制细胞核蛋白中NF-κB p65的表达水平。综上，miR-1246可能通过激活NF-κB信号，从而促进P-gp蛋白表达上调，进而诱导乳腺癌SK-BR-3细胞对PTX耐药。本研究发现，miR-1246介导乳腺癌细胞化疗耐药的新机制，可为临床治疗提供理论参考，但有关miR-1246的生物学作用还不够完善，有待进一步研究。