缺氧调控耳蜗听神经元电压门控性钾通道的表达*

冯 爽，刘少锋，周佳霖，黄振云，罗仁忠，孙昌志

(广州市妇女儿童医疗中心耳鼻咽喉科，广东 广州 510120)

耳蜗缺氧性损伤是新生儿缺氧性脑病常见的并发症，可引起中到重度感音神经性耳聋。此外，耳蜗组织缺血缺氧，同样是众多感音神经性耳聋，如噪音性聋、突发性聋、药物性聋等的病理生理学机制之一。因此，探索缺氧后耳蜗损伤的机制，对耳聋防治具有重要的临床治疗指导意义。已知听神经元对缺氧十分敏感，缺氧程度越重，持续时间越长，对听神经元不可逆的损害越严重，听力恢复也越困难。缺氧后可导致耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGN)水肿、坏死，听神经传入纤维大量崩解及缺失，损伤SGN。SGN的损伤程度与缺氧时间呈正比[1]。可见SGN是缺氧引起耳蜗损伤的靶器官之一。最近研究还发现，缺氧后可影响听神经元的兴奋性。SGN急性缺氧后，可增强其外向钾电流，促进钾离子外流到细胞外，使SGN细胞膜电位超极化，影响听神经动作电位发放频率[2]。可见，缺氧可影响听神经动作电位。缺氧对SGN外向钾电流的促进过程，主要通过TEA敏感的大电导钙激活钾通道电流(BKCa)介导，但对SGN电压门控性钾通道(Kv)电流无明显影响，可能并不作用于Kv电流。然而，在中枢神经缺氧后可影响Kv的表达及功能，而且该作用具有亚型特异性的特点，不同的Kv亚型有不同的表现，如缺氧可增大Kv2.1的电流大小，并使其在神经元的表达定位发生变化，使细胞膜电位超极化而抑制神经元的兴奋性；对于Kv4.2和Kv4.3，缺氧后则降低其在神经元的表达，并抑制电流大小，促进细胞膜去极化而增强神经元兴奋性[3-5]。目前尚不明确缺氧后对SGN Kv表达的作用特点。已知Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1均在SGN表达，可介导听神经动作电位的产生和传导，确保维持正常听力[6]。因此，本研究将探讨缺氧后SGN Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1表达的特点，明确缺氧对SGN Kv表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠由南方医科大学动物中心提供，出生后3～5 d，不论雄雌。

1.2方法

1.2.1SGN的原代培养 大鼠断头处死后，取出耳蜗，迅速置于4 ℃ Hank′s平衡盐溶液中，在立体显微镜下，打开耳蜗，剥离螺旋韧带、血管纹及Corti′s器，将螺旋神经节组织切碎，置入0.25%胰蛋白酶中，37 ℃下孵育10 min。吸去胰酶并终止消化，吹打后收集上清液，离心后再弃去上清液，细胞重悬后，种植到装有预热好的DMEM/F12+10%FBS培养皿中。培养24 h后，给予缺氧处理。

1.2.2缺氧处理及分组 将载有SGN的培养皿随机分为对照组和实验组。对照组置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。实验组置于缺氧罐内(“无氧环境”下)培养24 h(37 ℃，气体浓度为95%N2、5%CO2、O2<0.5%)。

1.2.3实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR) 利用Trizol法分别提取对照组和实验组细胞的总RNA,随后将提取到的RNA进行逆转录，以ACTB为内参，在PCR仪上进行扩增，ACTB的上游引物序列为5′- TCAGCAAGCAGGAGTACGATG-3′；下游引物序列为5′- GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACA-3′，扩增产物为88 bp。Caspase-3上游引物序列为5′- GAGCTTGGAACGCGAAGAAA-3′，下游引物序列为5′-AGTCCATCGACTTGCTTCCA-3′，扩增产物为112 bp。Kv1.1α亚单位的上游引物序列为5′-GCCGCAGCTCCTCTACTATC-3′，下游引物序列为5′-CCTGCCTGTAGTGGGCTATG-3′，扩增产物为84 bp。Kv1.2α亚单位的上游引物序列：5′-AGTGAGAAGATGTGACGGGAC-3′，下游引物序列为5′-GGAGCTGAGGTTCTCTTCCTTG-3′，扩增产物为85 bp。Kv3.1α亚单位的上游引物序列为5′-TACGGACCCTGCTTCCTCTT-3′，下游引物序列为5′-TGCAAAGATCCTTTCTCATTCCT-3′，扩增产物为76 bp。将扩增完毕的cDNA，按照qPCR法进行定量分析，结果重复3次。

2 结 果

2.1缺氧对caspase-3在SGN表达的影响 原代培养的SGN进行无氧处理24 h后，收集细胞。提取全部RNA后，qPCR结果显示凋亡执行因子caspase-3 mRNA在SGN的表达出现明显上调，与对照组相比增加78.3%(n=5,P<0.05)，见图1。

注：aP<0.05。图1 无氧处理24 h后SGN caspase-3 mRNA表达上调

2.2缺氧对Kv在SGN表达的影响 进一步实验发现,在无氧环境下，SGN Kv1.1、Kv1.2及Kv3.1α亚单位mRNA表达水平均显著上调；与对照组相比，其相对表达量分别增加3.71倍(n=5,P<0.05)、3.59倍(n=5,P<0.05)及4.33倍(n=5,P<0.05)，见图2～4。

注：aP<0.05。图2 无氧处理24 h后SGN Kv1.1 α亚基 mRNA表达上调

注：aP<0.05。图3 无氧处理24 h后SGN Kv1.2 α亚基 mRNA表达上调

注：aP<0.05。图4 无氧处理24 h后SGN Kv3.1 α亚基 mRNA表达上调

3 讨 论

Kv主要由α和β两种亚单位构成。关于Kv的分类，曾有多种不同分类方法，但各有缺陷。按照最新的分类方法，根据通道蛋白结构和种系发生特点，将Kv分为3大类38种亚型[7]。在中枢神经系统，神经元对缺氧十分敏感。当出现缺氧后，神经元出现短暂的超极化后，神经元迅速显著地去极化，并伴随钙离子内流，从而使神经元过度兴奋，加重缺氧引起的神经元损伤。有研究发现，缺氧后出现短暂超极化，主要是由于缺氧早期后，大量消耗ATP，对ATP十分敏感的ATP敏感型钾通道开放，钾离子外流，细胞膜超极化，这可能有助于防止神经元过度兴奋而损伤。然而，随着缺氧的持续，神经元逐渐去极化，出现兴奋毒性作用，此过程较为复杂，主要包括两方面，抑制Kv，减少钾离子外流，以及促进钠离子通过电压门控性钠通道或其他离子通道大量内流。如在海马神经元，缺氧后可使Kv2.1发生快速可逆的磷酸化反应，钾离子外流减少，使NMDA受体出现过度兴奋，介导以钙离子及钠离子内流为主要特征的兴奋毒性作用。因此，有观点认为，激活Kv有助于防止缺氧后对神经元造成的兴奋毒性损伤。研究发现，氟吡啶作为Kv通道开放剂，可减轻缺氧导致的神经组织损伤，部分恢复由缺氧引起的学习及记忆能力受损[8]。然而，另有研究发现，缺氧后可使有活性的Kv离子通道增加，电流密度增加[9]。可见在不同部位神经元，缺氧后Kv的表现差异较大。

现已发现所有Kv的亚型均在SGN上表达，其中Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在SGN是高表达，主要定位于基底回[6]。Kv1.1、Kv1.2主要介导低电压激活的外向钾电流，具有快速激活、快速失活的特点，使细胞膜电位保持在接近动作电位阈值的状态，有助于听神经元高频放电[10]。Kv3.1是介导延时整流外向电流的主要成分，有助于SGN膜电位快速复极化，有利于动作电位的产生，因此也是确保听神经元高频放电的重要因素[11]。因此，Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在基底回高表达的原因，可能是有利于此处SGN易于高频放电的原因。在本研究中，SGN处于无氧环境下处理24 h后，Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1α亚单位mRNA表达均显著上调，说明长时间严重缺氧，可上调Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1在SGN的表达。由此可推测，增加神经元放电频率，将影响听神经动作电位的传导，这可能是其引起听力下降的机制之一。

然而，本研究结果与既往文献报道的结果不同。有研究发现，急性缺氧(无氧处理5～15 min)后SGN的TEA敏感的BKCa电流大小增加，而4-AP敏感的Kv则无明显改变，因此认为介导缺氧对外向钾通道电流作用的主要是BKCa，认为Kv可能不参与此过程[2]。结合本研究结果，分析产生差异的原因，可能与缺氧处理时间不同有关。在本研究中，SGN持续处于无氧环境下24 h，属于长期严重缺氧；而文献报道的无氧状态最长仅维持15 min，属于短期急性缺氧。缺氧时间的不同，可能对SGN不同类型钾通道有不同的作用。推测在缺氧早期，主要影响SGN BKCa的功能，随着缺氧持续时间的延长，可能进一步影响Kv的表达，共同促使细胞膜电位超极化，抑制SGN放电，影响听觉动作电位。

本研究还发现，缺氧后可以增加caspase-3的表达，这说明缺氧可促进SGN凋亡过程，导致SGN损伤。既往有研究发现，Kv与凋亡过程有关。如通过调控细胞膜表面Kv1.1及Kv1.3的表达及其电生理学特性，增加开放频率，促进钾离子外流，使胞质钾离子浓度降低，细胞内容量降低，细胞皱褶，引起细胞凋亡过程[12]。另有研究也发现，敲除Kv1.1在细胞的表达，可增加抑制-Bcl的表达；而敲除Kv1.3，则减少caspase-3和促凋亡因子Bad的表达。可见在凋亡过程中，Kv可影响caspase-3等凋亡相关因子的表达，从而影响凋亡过程[13]。因此，推测缺氧后SGN Kv1.1、Kv1.2和Kv3.1表达增加，增加钾离子外流，可能引发caspase-3介导的细胞凋亡过程，加重SGN的损伤，这有待进一步研究证实。