老年原发性肝癌病人血清微小RNA-200a、微小RNA-221表达与介入术后感染的相关性分析

杨明，魏琦，易琨，张征，左伟

原发性肝癌为我国常见恶性肿瘤，起病隐匿，进展迅速，多数病人就诊时已为中晚期，错失最佳手术时机，经肝动脉栓塞化疗（transarterial chemoembolization，TACE）介入术为现阶段无法进行手术治疗肝癌病人首选治疗方法［1-4］。据调查显示，与TACE介入术相关短暂细菌感染发生率高达4%，肝脓肿发生率约1.4%，而TACE介入术后肝脓肿形成未及时采取适当治疗，病死率为13.4%～50.0%［5］。因此，探讨原发性肝癌病人介入术后感染相关危险因素，寻找介入术后感染诊断标志物尤为重要。近年来，微小RNA（microRNA，miRNA）作为一类具有多重生物学效应的内源性非编码单链小分子RNA逐渐出现在研究者视野［6-7］。研究发现，miR-200a、miR-221在肝癌病人血液中处于异常表达状态，通过上调或下调其表达可抑制肝癌发生发展，推测二者极大可能参与了肝癌发生［8-9］，但关于其与老年原发性肝癌病人介入术后感染的相关性研究较为鲜见。本研究选取45例老年原发性肝癌介入术后感染病人作为研究对象，并设置病例对照，以探索老年原发性肝癌病人血清miR-200a、miR-221表达与介入术后感染的相关性，旨在为临床诊疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年5月至2020年4月武汉市汉口医院45例老年原发性肝癌介入术后感染病人作为观察组，另自同期住院的老年原发性肝癌介入术后未出现感染病人中通过SPSS 21.0统计软件采取随机数字表法抽取45例作为对照组。纳入标准：（1）所有肝癌病人诊断标准依据《原发性肝癌诊疗规范（2011年）》［10］，感染定义：介入术后，病人在血液、痰液、腹腔积液或肝脏穿刺液中检测到细菌感染，或出现发热、白细胞升高等炎症反应的临床表现；（2）肝功能Child-Pugh A、B级，无远处转移；（3）未预防性使用抗生素；（4）未合并严重心、肾、肺功能不全等介入禁忌证；排除标准：（1）转移性肝癌者；（2）既往胃肠道、胆道手术史者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集病人三类可能与介入术后感染相关的潜在危险因素，包括一般资料（年龄、性别）、术前检查结果［乙型肝炎表面抗原（HB-sAg）、腹水、血红蛋白、白蛋白、血小板、凝血酶原时间、胆红素、谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、术中资料（肿瘤血供、异位栓塞、部分脾脏栓塞）］。

1.2.2 血清miR-200a、miR-221表达 空腹状态下，抽取外周静脉血5 mL，3 000 r/min高速离心处理10 min，离心半径为15 cm，采用血液RNA提取试剂盒分离获取RNA，采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒将RNA中的miRNA反转录为对应cDNA，采用miRNA荧光定量聚合酶链式反应检测试剂盒配置反应体系，按照说明书设定反应程序对miR-200a、miR-221和U6进行扩增反应，自动生成扩增曲线后，以 U6 为内参基因，以 2-ΔΔCt计算 miR-200a、miR-221相对表达量。

1.3 统计学方法采用统计学软件SPSS 21.0处理数据，计量资料采取Bartlett方差齐性检验与夏皮罗-威尔克正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态布，以±s描述，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用例（%）表示、χ2检验；采用logistic多因素回归模型分析老年原发性肝癌病人介入术后感染影响因素；采用Spearman相关性分析血清miR-200a、miR-221表达与影响因素的关系；绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristiccurve，ROC）得到曲线下面积（areas under the curve，AUC），检验血清miR-200a、miR-221表达对老年原发性肝癌病人介入术后感染的预测价值；绘制卡普兰-迈耶曲线（Kaplan-Meier，KM），对比不同血清miR-200a、miR-221表达病人生存情况。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较观察组腹水、白蛋白＜30 g/L、异位栓塞、部分脾脏栓塞比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 老年原发性肝癌介入术后感染及未感染组临床资料对比

2.2 两组血清miR-200a、miR-221表达两组术前血清miR-200a、miR-221表达相比，差异无统计学意义（P＞0.05），术后，观察组血清miR-200a表达低于对照组，miR-221表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 老年原发性肝癌介入术后感染及未感染组血清miR-200a、miR-221表达对比/± s

表2 老年原发性肝癌介入术后感染及未感染组血清miR-200a、miR-221表达对比/± s

组别对照组观察组t值P值例数45 45 miR-200a术前4.54±1.09 4.62±1.13 0.34 0.733术后4.69±1.14 2.84±0.74 9.13＜0.001 miR-221术前9.24±2.31 9.65±2.08 0.89 0.379术后9.05±2.43 12.37±3.02 5.75＜0.001

2.3 老年原发性肝癌病人介入术后感染影响因素分析以老年原发性肝癌病人术后是否发生感染为因变量（赋值：否=0，是=1），将表1，2中筛查出的P＜0.05的因素作为自变量，进行logistic回归分析，结果显示腹水、白蛋白＜30 g/L、异位栓塞、部分脾脏栓塞、术后血清miR-200a、miR-221表达均为老年原发性肝癌病人介入术后感染影响因素（P＜0.05）。见表3。

表3 老年原发性肝癌病人介入术后感染影响因素分析

2.4 血清miR-200a、miR-221表达与影响因素的关系老年原发性肝癌介入术后感染病人术后血清miR-200a表达与腹水、异位栓塞、部分脾脏栓塞呈负相关关系，与白蛋白呈正相关关系（P＜0.05）；术后血清miR-221表达与腹水、异位栓塞、部分脾脏栓塞呈正相关关系，与白蛋白呈负相关关系（P＜0.05）。见表4。

表4 血清miR-200a、miR-221表达与影响因素的关系

2.5 血清miR-200a、miR-221表达对老年原发性肝癌病人介入术后感染的预测价值绘制ROC曲线，评价血清miR-200a、miR-221表达对老年原发性肝癌病人介入术后感染的预测价值，发现，二者联合预测AUC最大，预测效能良好。见表5。

表5 血清miR-200a、miR-221表达对老年原发性肝癌病人介入术后感染的预测价值

2.6 生存曲线以ROC曲线中截断值为界，将原发性肝癌病人分为血清miR-200a、miR-221高表达与低表达组，miR-200a高表达组3个月病死率低于低表达组，miR-221高表达组3个月病死率高于低表达组，差异有统计学意义（χ2=4.27，4.13，P＜0.05）。

3 讨论

目前，TACE介入术已被公认为中晚期原发性肝癌首选治疗方法，随着该方法在各级医院普及应用，其感染相关并发症逐渐出现，受到临床高度重视［11-13］。老年原发性TACE介入术后感染发生多由综合因素引起，这种感染可能与栓塞后引起的宿主自身变化有关，如菌群移位、胃肠屏障改变、自身免疫力下降等［14］。本研究logistic回归分析显示，腹水、白蛋白、异位栓塞及同时行部分脾脏栓塞均为介入术后感染影响因素。腹水作为细菌生长良好的培养基，介入术后肝脏肿瘤坏死刺激腹膜炎性渗出，易引起腹腔感染。血清白蛋白作为反映机体一般营养状况及肝脏储备功能的重要指标，其水平下降，可致使抗体合成的各种酶减少，酶活性下降，机体免疫功能减退，感染风险增加。异位栓塞为肝癌介入术后主要严重并发症之一，主要是因栓塞肿瘤肝外动脉血供导致，尤其是多次TACE后，肝外供血动脉成为肝癌主要血供，可引起组织坏死，诱发感染。介入术中同时行部分脾脏栓塞后，脾脏组织坏死、炎性水肿、大量渗出液刺激腹膜、膈肌，极易导致膈下脓肿及脾脏脓肿形成。因此，对于出现上述情况的病人，临床需加以重视。

近年来，大量研究表明，细胞内非编码的miRNA调节基因表达，影响细胞信号转导通路，促进细胞增殖、凋亡等生物学过程［15-16］。miRNA可结合靶基因3，端非编码区相应靶点，改变靶基因mRNA生物稳定性，诱导mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻译过程，参与肿瘤、炎症及免疫反应等多种生理病理过程［17-18］。原发性肝癌发生发展过程中，伴有miRNA表达异常，包括上调或下调，调节不同生物学效应［19-20］。miR-200 家族分为 miR-200a与 miR-200b两个亚家族，其中miR-200a亚家族包括miR-200a与miR-141，定位于染色体1p36，为肿瘤细胞上皮间质转变主要调节因子［21］。miR-200a表达缺失或下调后，下游靶基因Rho激酶（ROCK）2表达上调，Rho/ROCK信号传导通路的活化可促进肌蛋白收缩，黏着斑转换及应力纤维形成，从而促进肿瘤细胞的转移［22］。以往研究证实，原发性肝癌病人miR-200a表达明显下调［23］，充分说明miR-200a参与原发性肝癌发生、发展。本研究中，观察组术后miR-200a较术前明显下降，且低于对照组术后，提示原发性肝癌病人介入术后miR-200a继续下调与感染有关。炎症反应为介入术后感染的重要发病机制，有研究指出，miR-200a参与机体炎症反应，可降低血管内皮细胞炎症反应［24］。另有研究指出，miR-200a可通过抑制黏附分子表达，增加黏附抑制分子表达，进而抑制炎症反应［25］。因此，本研究推测，老年原发性肝癌病人介入术后发生感染，炎症反应剧烈，miR-200a表达明显下调。

在癌症相关miRNA研究中发现，miR-221在肝癌、胃癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞中表达明显上调，呈现出一种“通用”癌基因特性［26］。miR-221位于X染色体p11.3约1 kb区域内，是通过碱基互补配对原则与靶mRNA结合，进而在转录后引起靶mRNA降解或抑制其翻译成蛋白质，其作用机制可能是通过对Bmf、p27、DDIT4多种基因的调控来调节细胞周期及分化，抑制细胞凋亡，从而参与调控肿瘤形成［27］。原发性肝癌病人miR-221表达明显上调，且研究表明其上调与病人临床病理特征及总体生存率有关［28］，充分说明miR-221与原发性肝癌病人发生、发展及预后有关。本研究中观察组术后miR-221较术前明显升高，且高于对照组术后，提示原发性肝癌病人介入术后miR-200a继续升高与感染有关。TLR-4/NF-κB作为机体内调节炎症反应的关键途径，有研究证实，miR-221可靶向影响该通路激活，进而通过其变化来激活炎症反应，靶向影响炎症细胞因子释放［29］，故推测原发性肝癌介入术后感染与miR-221靶向激活炎症反应有关。此外，本研究中，术后血清miR-200a、miR-221表达与老年原发性肝癌病人介入术后感染影响因素腹水、白蛋白、异位栓塞及同时行部分脾脏栓塞有关，提示血清miR-200a、miR-221表达参与介入术后感染发生、发展。基于此，本研究绘制ROC曲线，评价血清miR-200a、miR-221表达对老年原发性肝癌病人介入术后感染的预测价值，发现术后血清miR-200a、miR-221表达联合预测介入术后感染，预测效能良好，且以ROC曲线中截断值为界，将原发性肝癌病人分为血清miR-200a、miR-221高表达与低表达组，miR-200a高表达组3个月病死率低于低表达组，miR-221高表达组3个月病死率高于低表达组，推测术后血清miR-200a、miR-221表达可预测病人预后，但本研究样本量较小，还需临床多中心、多渠道取样，作进一步证实。

综上所述，老年原发性肝癌介入术后感染病人血清miR-200a表达明显下调，miR-221显著上调，临床检测其水平，可早期诊断感染，合理制定治疗方案，有助于改善预后。