利用拉曼光谱技术研究低剂量X射线辐射对人神经母细胞瘤细胞的影响

2023-01-31陈珊，林兰，陈钧，刘樱*

光谱学与光谱分析 2023年1期

陈珊，林兰，陈钧，刘樱*

1.中国工程物理研究院材料研究所，四川绵阳 621907 2.四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室分子医学中心，四川成都 610041 3.表面物理与化学重点实验室，四川江油 621908

引言

低剂量电离辐射(通常指200 mGy以下)普遍存在于自然和人工环境中，其细胞生物学效应相较于高剂量电离辐射更加隐秘、复杂而多样[1-2]。低剂量辐射生物效应在生物医学和临床医学等领域具有重要的研究意义和应用价值，但目前仍然缺乏理想的低剂量辐射生物标志物以及简易快速的生物效应分析检测技术手段[3]。

拉曼光谱是基于拉曼散射效应的分子振动光谱，既可以检测分子结构的变化，也能够检测分子组成的变化[4-5]。拉曼光谱在生命科学研究领域有着独特的技术优势，诸如：高灵敏度，样本无需标记、无需复杂的预处理，可实现原位定点检测，等等[6]。目前已经建立了包括核苷酸、多肽、脂类在内的诸多生物分子的拉曼图谱[7-12]。本文利用共聚焦拉曼光谱技术研究低剂量X射线辐射对人神经母细胞瘤细胞的影响，探索一种相对简易的、能够及时发现早期低剂量辐射生物学效应的新方法。

1 实验部分

1.1 细胞培养

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购买自揽宝生物(中国上海)，在含有10%FBS(Hyclone，美国)和1%三抗(Gibco，美国)的DMEM培养基(Biological Industries，以色列)中，于37 ℃，5%CO2的合适湿度中培养。

1.2 X射线辐照

采用X-RAD 320辐照仪(Precision X-Ray Incorporated，美国)和F2滤板(1.5 mm Al+0.25 mm Cu+0.75 mm Sn)对细胞进行照射，电压320 kV，电流2 mA，单次源靶距60 cm，剂量率1.8 mGy·s-1。辐照剂量分别为0(对照)，100，200和500 mGy。

1.3 样品制备

将SH-SY5Y细胞以5×104细胞/孔的密度接种在6孔板(Corning，美国)中的24 mm圆形玻璃盖玻片(Solarbio，中国北京)上，并培养过夜。辐照后静置30 min，将细胞用PBS洗涤一次，并用4%多聚甲醛(Solarbio)固定30 min，然后用PBS洗涤两次。盖玻片上的细胞在检测之前存储在4 ℃。

1.4 光谱采集

拉曼光谱测量采用自研的共聚焦拉曼光谱设备进行，激发光波长为532 nm，激光功率10 mW，使用100×物镜(NA=0.90)聚焦激光和收集拉曼信号。设备已经过氖灯灯线进行光谱线性和频率校正，并进一步采用硅和金刚石拉曼信号进行校正。光谱分辨率为3.6 cm-1，连续采集光谱的信号重复性优于0.1 cm-1。

每个拉曼图谱由3次信号采集平均而得。每个样品采集10～15个细胞，每个细胞采集细胞核内7～10个不同位点；由此，每个样品采集100多个图谱，取其平均用于比较和分析。玻璃盖玻片的拉曼信号同样被采集，并在后续分析中扣除。

1.5 细胞周期分析

X射线照射后的细胞继续培养6 h。用胰蛋白酶(普诺赛，中国武汉)消化后收集细胞，用PBS洗涤一次，以2 500 r·min-1的速度离心4 min，然后用70%的乙醇固定并在4 ℃孵育过夜。细胞周期分析试剂盒(碧云天，中国江苏)用于检测细胞周期。细胞以2 500 r·min-1的速度离心4 min后用PBS洗涤一次，将细胞沉淀重悬于500 μL染料结合溶液中，并与RNase A(50 μg·mL-1)和PI(20×)在37 ℃孵育30 min。使用流式细胞仪(Accuri C6 Plus，BD Biosciences，美国)分析样品。

1.6 细胞迁移分析

利用划痕实验检验X射线对细胞迁移的抑制。SH-SY5Y细胞在24孔板(Corning)中培养24 h，然后用10 μL枪头在汇合的单层细胞上划一道，用PBS洗涤划痕两次，以除去未贴壁的细胞碎片，并向每个孔中加入2 mL新鲜的10%培养基。X射线照射后培养20 h，以100倍放大倍数在显微镜(Mshot，中国广州)下拍摄穿过伤口区的迁移细胞。手动测量划痕面积，计算20 h后划痕面积占之前划痕面积的百分比。比值越大，则迁移水平越低。

1.7 统计学分析

每组实验进行三次或三次以上生物学重复，并计算平均值和标准偏差。单因素方差分析用于成对数据，多因素方差分析用于分析成组数据。p<0.05的值被定为具有显著的统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 拉曼光谱分析显示辐照后细胞内核苷酸水平变化

图1显示的是不同剂量X射线辐照之后的细胞样品的拉曼光谱(已扣除玻璃盖玻片本底信号)。灰色标记的4个拉曼峰与DNA相关：725 cm-1(腺嘌呤)[9]、780 cm-1(O—P—O stretching、嘧啶核苷酸)[9-10]、1 093 cm-1(O—P—O stretching)[9, 11-12]、1 580 cm-1(腺嘌呤、鸟嘌呤)[9]。我们对这4个拉曼特征峰进行积分，计算获得了相应的峰面积，列入表1。X射线辐照过的细胞相较于对照细胞的4个拉曼峰面积均有不同程度的增加，提示DNA相关物质的水平可能因电离辐射而升高。

图1 SH-SY5Y细胞经不同剂量(0，100，200和500 mGy)X射线辐照后的拉曼光谱

表1 峰面积积分结果

将图1中三个辐照剂量的细胞拉曼图谱减去未接受辐照的对照细胞图谱，获得3条差谱(图2)。图2中灰色标记的拉曼峰均与DNA相关(表2)，结果同样提示DNA水平可能因电离辐射而升高。

表2 已知DNA相关的拉曼峰[9]

图2 SH-SY5Y细胞经不同剂量(100，200，500 mGy)X射线辐照后相较于对照(0 mGy)的拉曼差谱

2.2 细胞周期分析显示辐照促进细胞G2期阻滞

SH-SY5Y细胞经X射线照射后继续培养6 h之后，检测其细胞周期分布情况。相较于未接受辐照的对照细胞，三个剂量的电离辐射均造成细胞在G2期停滞(p<0.01)，但三个剂量之间没有统计学意义的差别(p>0.05)。细胞G2期的DNA含量是G1期的2倍，因此细胞周期分析结果与拉曼图谱分析结果一致，均提示电离辐射引起DNA水平升高。