两种不同提取方式下荔枝草提取物中三种有效成分含量的对比

杜晓映

(潍坊理工学院，山东 青州 262500)

荔枝草(Salvia plebeian R.Br.)是唇形科鼠尾草属草本植物，也称为青蛙草、蛤蟆草、皱皮草、雪见草等。荔枝草味苦性寒凉，具有诸多功效，如清热解毒、利尿消炎、止血凉血等[1]。故可用于治疗呼吸道炎症、扁桃体炎、肾炎水肿、便血等疾病，外用可治疗某些妇科疾病[2]。荔枝草在我国分布广泛，主产于我国江苏、安徽、福建、山东、河南等地，资源丰富，是一种很有前景的药用植物。

我国民间广泛运用荔枝草的功效治疗疾病，随着技术的进步，科研人员从荔枝草的药理作用出发不断探究其中的化学成分。研究表明，荔枝草中主要含有黄酮类、萜类、酚酸类、挥发油、植物甾醇类等多种化合物[3,4]，其中，黄酮类化合物具有抗氧化、预防心血管疾病、抗老化等功效，是众多中药的有效成分[5]。高车前苷是荔枝草中富含的一种主要的黄酮类化合物，药理研究表明，高车前苷具有止咳平喘、抑菌、祛痰及保肝、抗组胺等作用[6]。齐墩果酸是萜类化合物的一种，也是荔枝草功能性成分之一，具有保肝、解毒功能，目前齐墩果酸已经成为临床上治疗急性和慢性肝炎的药物之一[7-9]。除此之外，齐墩果酸还具有降糖，降血脂，抗炎，抗细菌、病毒和原虫，抗氧化，抗突变，抗心脑血管疾病，促进创伤恢复，抗肿瘤，增强免疫调节等多种功能。本研究通过对水提和醇提2种提取方法下获得的荔枝草浸膏中总黄酮、高车前苷、齐墩果酸含量的测定与比较，为荔枝草产品的进一步开发应用提供参考。

1 材料

主要仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪；RE52CS-1旋转蒸发器；UV5200紫外可见分光光度计；HH-4数显恒温水浴锅。

实验样品购于当地药房，来源于河南，为荔枝草干草全株。

2 方法与结果

2.1 荔枝草浸膏的提取

荔枝草的干燥全草，除去黄叶、杂质，研碎成粗粉，以水或70%乙醇为溶剂，通过浸泡、加热回流、抽滤、50℃减压蒸馏得到浸膏。以浸膏得率为标准，优选实验方案，其中，水提法浸泡时间1h，回流时间1h，料液比1∶15；醇提法乙醇浓度70%，料液比1∶20，回流时间2h。

2.2 浸膏中总黄酮含量的测定

将醇提浸膏和水提浸膏干燥后各取1g，置于100mL小烧杯中，加70%乙醇进行溶解，过滤后转移至100mL容量瓶中定容，混匀后得黄酮提取液，待用。

2.2.1 芦丁标准曲线的绘制

电子天平精确称取芦丁标准品5mg，用70%乙醇溶解至小烧杯中，于25mL容量瓶中定容，摇匀，得到标准品溶液浓度为0.2mg·mL-1。移液枪准确吸取标准溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分别置于7个已编号的10mL容量瓶中。先分别向上述7个容量瓶内加入5% NaNO20.4mL，摇匀，避光静置6min；后加入10%A1(NO3)30.4mL，摇匀，避光放置6min；最后加入5%NaOH 4.0mL，再加水定容，摇匀，避光放置15min。将上述溶液加到玻璃比色皿的2/3处，用70%乙醇作参比溶液，在510nm波长下依次测定吸光值后，根据数据绘制标准曲线并求出标准曲线方程和拟合参数[10]。

准确吸取上述提取液A、B、C各1.00mL于10mL容量瓶中，并按上述步骤依次加入5%NaNO2、10%A1(NO3)3、5%NaOH，再以70%乙醇作参比溶液，用比色皿在510nm波长处测定吸光度，用绘制出的标准曲线即可计算出总黄酮含量。

以不同浓度的标准品为横坐标，以紫外分光光度计搭配玻璃比色皿测定溶液在510nm处的吸光度值，测量多次后取平均值为纵坐标，进行作图，得到图1所示芦丁标准曲线。

图1 芦丁标准曲线

以最小二乘法做线性回归，得方程为y=11.075x-0.0275，R2=0.9841，其中，y为吸光度值(A)；x为标准品浓度(mg·mL-1)；R2为拟合参数，0

2.2.2 样品中总黄酮的测定结果

按照标准曲线的方法测定水提法和醇提法的提取物中总黄酮含量，水提法中提取物总黄酮含量为15.6mg·g-1，醇提法中提取物总黄酮含量为16.3mg·g-1，醇提法要高于水提法。在此基础上，若加大乙醇回流时间至3h，醇提浸膏中黄酮得率可达到2.73%，换算成荔枝草干草中黄酮含量为1.5mg·g-1。

2.3 浸膏中齐墩果酸含量的测定

浸膏干燥后称取5g溶解于20mL去离子水中，溶解液倒入分液漏斗中，加入适量水饱和的正丁醇在通风橱中分3次进行萃取，收集萃取液，再用旋转蒸发仪除去正丁醇至无醇味为止，将圆底烧瓶内蒸发剩余物用甲醇溶解，并定容于50mL容量瓶中[11-14]。用紫外分光光度计进行测定其吸光度，测3次取平均值(若数值偏大，稀释后再测定，使数值处于线性范围内)。

2.3.1 齐墩果酸标准曲线绘制

准确称量齐墩果酸标准品(CAS：508-02-1；分子式：C30H48O3)10.0mg，用甲醇进行充分溶解，再定容至50mL，摇匀后即得标准品溶液，其浓度为0.2mg·mL-1[15]。用移液枪精密吸取标准品溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、7mL，再用甲醇定容于10mL容量瓶中，即得0.01mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.03mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1、0.14mg·mL-1的标准品溶液。用紫外分光光度计在258nm波长下测定其分光光度值，绘制齐墩果酸在258nm下的标准曲线及回归线方程[15,16]。

采用紫外分光光度法测定齐墩果酸标准品配制的密度梯度溶液，测得标准曲线方程为y=0.0047x-0.0258，R2=0.9946。结果表明，齐墩果酸在10～140mg·g-1范围内具有良好的线性关系。

图2 紫外分光光度法测齐墩果酸标准曲线

2.3.2 样品中齐墩果酸的测定结果

按照标准曲线的方法测定水提法和醇提法的提取物中齐墩果酸含量。其中，醇提法测得齐墩果酸含量为0.187mg·g-1，水提法测得齐墩果酸含量为0.104mg·g-1，醇提法大于水提法。在此基础上，若提前浸泡1h并加大乙醇回流时间至3h，齐墩果酸含量可达0.245mg·g-1。折合到干草中齐墩果酸含量为0.093mg·g-1。

2.4 浸膏中高车前苷含量的测定

2.4.1 对照品溶液的配制

精密称取对照品6mg，置于10mL的量瓶中，用流动相(52%甲醇)定容至刻度，得浓度为604mg·L-1的高车前苷储备液。再吸取上述储备液2mL加流动相定容至10mL，即得高车前苷标准品溶液。

2.4.2 供试品溶液的配制

不同提取方式荔枝草提取物的制备：将醇提浸膏和水提浸膏干燥后分别稀释至浓度为0.8g·mL-1，高速离心后上清液通过D101大孔树脂柱，用10倍柱体积70%的无水乙醇通过大孔树脂，收集70%无水乙醇部分，回收乙醇后，水浴蒸至近干，减压干燥，研钵研细，过80目筛即得样品。

精密称取荔枝草提取物样品10mg，加流动相(50%甲醇)，超声溶解，定容至10mL，摇匀。

2.4.3 色谱条件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm),流动相色谱甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(v/v，52∶50)，柱温35℃，流速1mL·min-1，检测波长335nm[6]。按上述色谱条件对对照品和供试品分别测定，结果塔板数>5000，分离度R>1.5，对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图3、图4。

注：浓度604mg·L-1，进样10μL，波长335nm。

注：进样10μL，波长335nm。

以进样量对峰面积进行线性回归，得回归方程y=1027.5x-7.1324(R2=0.9995)，结果表明,高车前苷在0.20～2.01μg范围内线性关系良好。对色谱条件进行精密度、稳定性、重复性及加样回收试验，表现良好。

2.4.4 不同提取方式的样品中高车前苷的含量测定

取水提法和醇提法样品各4批，进样10μL，HPLC测定，用标准曲线法计算，4批样品中高车前苷含量测定结果见表1。其中，水提法样品中高车前苷平均含量为0.498mg·g-1，醇提法样品中高车前苷平均含量为1.018mg·g-1。

表1 不同提取方式下1g荔枝草提取物样品中高车前苷的含量测定

3 讨论

3.1 浸膏的提取

在药用植物的开发利用中，往往需要先将植物的有效成分提取制成浸膏，再加工成产品，在浸膏的提取中，浸膏得率受多种因素的影响，本试验所用的水提法是以浸泡时间、料液比、回流时间为主要影响因素，醇提法是以乙醇浓度、料液比、回流时间为主要影响因素，分别作三因素三水平正交实验后，以浸膏得率为测定指标，优选的浸膏提取方案。

其中，水提法采用浸泡时间1h，料液比1∶15，回流时间1h。醇提法采用乙醇浓度70%，料液比1∶20，回流时间2h。在2种方法中水提法浸膏得率要略高于醇提法。

3.2 不同提取物3种成分的含量比较

经过反复试验发现，70%醇提下总黄酮、齐墩果酸、高车前苷的含量都远远高于水提样品中3种物质的含量。

本试验先以浸膏提取率为标准优选了水提法和醇提法中浸膏得率最高的2种方案，再对2种浸膏中总黄酮、齐墩果酸和高车前苷进行了测定与比较，需要注意的是，在浸膏的提取中，浸膏得率最大的方案并不是其有效成分最高的方案。如果加大浸泡时间或回流时间，可以进一步提高其有效成分的含量。该方法标准统一，因此测定结果相对可靠，对荔枝草富含的其他药用植物有效成分的进一步测定和荔枝草产品的进一步开发应用都具有一定的指导意义。