激素和有机质对铁皮石斛×重唇石斛F1代增殖的影响

江金兰

(三明市农业科学研究院药用植物研究所/福建省山区作物遗传改良与创新利用重点实验室，福建 沙县 365051)

石斛属(Dendrobium)植物为兰科(Orchidaceae)多年生附生草本植物，其中超过50种被认定有药用价值[1]。在自然界中，石斛属植物生长缓慢且繁殖能力极低，加之野生资源遭到严重破坏，因此培育石斛新品种变得越来越重要[2]。杂交育种是目前药用石斛品种创新和种质改良的主要手段[3]。

铁皮石斛(D.officinale)和重唇石斛(D.hercoglossum)均为中药石斛的基原植物，且具有较高的观赏价值。铁皮石斛是近年来发展最迅速、栽培最广泛、品质较好的药用石斛[4]；重唇石斛是铁皮石斛的近缘种，茎常被加工成扁黄草和“鸡爪兰”枫斗[5]，具有环境适应性强和生物产量大等特点。因此，开展铁皮石斛与重唇石斛的杂交，有望得到品质好、产量高的杂交后代。2013年以来，三明市农业科学研究院药用植物研究所开展了药用石斛种间杂交试验[4,6-9]，获得了铁皮石斛×重唇石斛等石斛杂交后代株系。

石斛属植物试管苗增殖主要通过原球茎增殖和芽增殖两种方式进行[10]。目前，黑毛石斛×鼓槌石斛[2]、金钗石斛×细茎石斛[11]、铁皮石斛×钩状石斛[12]等杂交后代的组织培养已有报道，但尚未见铁皮石斛×重唇石斛杂交后代组织培养的相关报道。在铁皮石斛×重唇石斛杂交后代组织培养过程中，发现存在增殖速度慢、增殖率低和苗较弱等问题，可能与培养基配方有关。因此，本研究比较了激素(6-BA、NAA)和有机质(香蕉泥)对铁皮石斛×重唇石斛种间杂交蒴果无菌播种长出的原球茎及小苗增殖的影响，以期为其杂交后代种苗规模化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以无菌播种的铁皮石斛×重唇石斛F1代原球茎和小苗为供试材料，由三明市农业科学研究院种苗繁育中心提供。

1.2 试验方法

试验于2021年8月进行，培养温度为(25±1) ℃，光照强度为1 500～2 000 lx,光照为14 h·d-1。

1.2.1 F1代原球茎的增殖 采用三因素三水平正交试验(表1)进行激素(6-BA、NAA)和有机质(香蕉泥)的配比，以优化铁皮石斛×重唇石斛F1代原球茎的增殖培养基配方。各处理以1/2MS+30 g·L-1蔗糖+1 g·L-1AC+5.6 g·L-1琼脂粉为基本培养基，pH值为5.6～5.8。每瓶接种20粒原球茎为1个重复，每个处理5个生物学重复。接种30 d后统计生长速度、折干率(60 ℃下烘干至恒质量)。生长速度=(增殖后原球茎质量-接种时原球茎质量)/接种时原球茎质量，折干率/%=(干质量/鲜质量)×100。

表1 铁皮石斛×重唇石斛F1代原球茎增殖正交试验因素和水平设计表1)

1.2.2 F1代小苗的增殖 采用三因素三水平正交试验(表2)进行激素(6-BA、NAA)和有机质(香蕉泥)的配比，以优化铁皮石斛×重唇石斛F1代小苗的增殖培养基配方。各处理以1/2MS+30 g·L-1蔗糖+1 g·L-1AC+5.6 g·L-1琼脂粉为基本培养基，pH值为5.6～5.8。每瓶接种20株小苗(株高1～2 cm)为1个重复，每个处理5个生物学重复。接种4个月后统计生长速度、增殖系数。生长速度=(增殖后苗质量-接种时苗质量)/接种时苗质量，增殖系数=增殖后的苗数/接种时的苗数。

表2 铁皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖正交试验因素和水平设计表1)

1.3 数据分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0对试验数据进行统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 激素和有机质对 F1代原球茎增殖的影响

接种30 d后，统计增殖后的原球茎生长速度及折干率(表3)。从表3可见，处理8原球茎生长速度最快(55.49)，极显著高于其他处理；折干率位居前三的依次为处理3(8.44%)、处理5(7.99%)和处理8(7.60%)，且三者间差异不显著。因此，综合考虑生长速度和折干率，最适宜原球茎增殖的为处理8，即：2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。极差分析结果(表3)表明，3个因素对生长速度的影响依次为：6-BA>香蕉泥>NAA，对折干率的影响依次为：香蕉泥>NAA>6-BA。根据各列k值大小可知，生长速度的最优组合(A3B2C1)为：2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，折干率的最优组合(A2B2C3)为： 1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+100 g·L-1香蕉泥。

表3 激素和有机质对铁皮石斛×重唇石斛F1代原球茎增殖的影响1)

主体间效应检验(表4)表明，6-BA、NAA和香蕉泥对铁皮石斛×重唇石斛F1代原球茎增殖的影响不显著，三者对增殖生长速度影响的主次关系为：6-BA>NAA>香蕉泥。9个处理的原球茎增殖形态见图1。从图1可见，生长速度最高的处理8(图1H)原球茎大部分颜色深绿且簇生多，长势均匀，增殖程度最佳；折干率最高的处理3(图1C)原球茎大部分颜色深绿，近40%的原球茎冒出芽尖，长势中等。

表4 激素和有机质对铁皮石斛×重唇石斛F1代原球茎增殖影响的主体间效应

A～I分别为处理1～9增殖的原球茎形态。

2.2 激素和有机质对F1代小苗增殖的影响

小苗接种4个月后，统计增殖后苗的生长速度及增殖系数(表5)。从表5可见，生长速度位于前二位的为处理1(78.55)、处理3(70.13)，二者的差异不显著；增殖系数位于前二位的为处理3(4.51)、处理2(3.91)，二者的差异不显著。综合考虑生长速度和增殖系数，最有利于小苗增殖为处理3，即： 1 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA+100 g·L-1香蕉泥。极差分析结果(表5)表明， 3个因素对生长速度的影响依次为：6-BA>香蕉泥>NAA，对增殖系数的影响依次为：6-BA>香蕉泥>NAA。根据各列k值大小可知，生长速度的最优组合(A1B1C1)为：1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，增殖系数的最优组合(A1B3C3)为： 1 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA+100 g·L-1香蕉泥。

表5 激素和有机质对铁皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖的影响1)

主体间效应检验(表6)表明，NAA和香蕉泥对小苗增殖的影响不显著，6-BA对小苗增殖的影响达显著水平(P<0.05)。3个因素对铁皮石斛×重唇石斛杂交F1代小苗生长速度的影响依次为：NAA>香蕉泥>6-BA，对小苗增殖系数的影响依次为：6-BA>香蕉泥>NAA。9个处理的小苗增殖见图2。从图2可见，生长速度最快的处理1(图2A)苗深绿色，长势均匀整齐，茎秆粗壮，根部具少量原球茎；增殖系数最大的处理3(图2C)苗绿色，长势整齐，稍弱，根部具少量原球茎。

表6 激素和有机质对铁皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖影响的主体间效应1)

A～I分别为处理1～9增殖苗的形态。

3 讨论与结论

3.1 激素对铁皮石斛×重唇石斛杂交F1代增殖的影响

组织培养中，适合的激素浓度和配比有利于石斛的增殖，反之则不然。付传明等[12]研究表明，当6-BA为2.0 mg·L-1时，铁皮石斛与钩状石斛(D.aduncum)杂交后代原球茎会出现玻璃化现象。陈春[13]研究表明，独角石斛原球茎在6-BA为3.0 mg·L-1时出现玻璃化。本研究也表明，过高的6-BA会导致铁皮石斛×重唇石斛F1代种苗过于细弱。当6-BA浓度在最优条件下，NAA质量浓度分别为0、0.5、1.0 mg·L-1时，原球茎平均生长速度为22.24、55.49、15.00，表明一定浓度的NAA会促进原球茎增殖，浓度过高易造成原球茎大量分化，对原球茎增殖影响显著。此结论与宋丽娟等[14]的研究相一致，即在铁皮石斛培养中，随着NAA浓度的升高，原球茎的分化率相应提高。因此，筛选出适宜的激素浓度和配比有利于原球茎的增殖，但不同种石斛对激素的响应存在一定差异。任海虹等[15]在铁皮石斛、许丁帆等[16]在玫瑰石斛(D.crepidatum)原球茎增殖中筛选出最适宜的培养基均为：1/2MS+1 mg ·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，增殖系数分别达23、6.04。本试验筛选出铁皮石斛×重唇石斛F1代原球茎增殖的适宜激素配比为：2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，生长速度达55.49。相比之下，本试验中6-BA质量浓度偏高，可能由于培养时间和培养条件不同所致。

3.2 有机质对铁皮石斛×重唇石斛杂交F1代增殖的影响

组织培养中常常添加香蕉泥等有机质来促进石斛的生长或提高增殖率，如铁皮石斛[14,17]、串珠石斛[18]、铁皮石斛与钩状石斛杂交后代[12]、玫瑰石斛[16]的芽苗分化、生根壮苗培养。本研究也表明，在铁皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖阶段，100 g·L-1香蕉泥可提高增殖系数和促进种苗株高、茎粗的生长。

本文以铁皮石斛与重唇石斛杂交F1代为试验材料，通过探讨原球茎与小苗增殖的激素与有机质配比实现了F1代增殖技术的优化，将进一步研究F1代壮苗生根及移栽等技术，以期为选育高产优质的石斛杂交品种提供新种质。