ADAM33基因T2位点多态性与支气管哮喘易感性的关联研究*

常永莉,张莉媛,王惠琴,王 冰,陈方园,李天浩

陕西中医药大学第二附属医院，陕西咸阳 712000

支气管哮喘是临床常见呼吸系统疾病，呈家族聚集性，多种细胞及细胞组分参与发病，与多基因遗传有关。有资料显示，全球约有3亿人患有支气管哮喘，在我国有超过3 000万人患有支气管哮喘，该病发病率较高，严重影响患者生命质量[1-2]。支气管哮喘的病因尚不明确，多认为环境暴露、遗传易感性相互作用决定着该病的发生和发展：环境因素是导致支气管哮喘发生及发展的重要因素，患者健康状况、精神心理状态、免疫状态、遗传因素等是影响易感性的重要因素，也是支气管哮喘发生、发展的主观条件[3-4]。许多研究者致力于支气管哮喘的遗传病因学研究，并试图证明支气管哮喘的易感基因，由此帮助人们了解支气管哮喘的病理过程。解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)是膜锚定蛋白，参与细胞-基质、细胞-细胞相互作用的各种生物过程，ADAM33基因单核苷酸多态性是近年研究热点。有研究探讨了支气管哮喘易感性、病情严重程度等与ADAM33基因单核苷酸多态性的关系，然而所得结果不尽相同，存在一定差异[5-6]，故本研究旨在探讨ADAM33基因T2位点多态性与支气管哮喘易感性的关联性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年12月至2020年12月在本院就诊并接受治疗的支气管哮喘患者120例作为研究对象，纳入研究组。患者年龄20～60岁、平均(38.62±5.51)岁，男61例、女59例。纳入标准：(1)支气管哮喘诊断符合《支气管哮喘防治指南》(2016版)[7]标准，处于急性发作期；(2)年龄>18岁；(3)临床病历资料及随访资料完整。排除标准：(1)合并肝、心、肾等脏器病变及血液系统等疾病者；(2)合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病者；(3)有血液系统疾病既往史者；(4)精神障碍无法正常沟通者。对纳入的患者进行病情分级后分组：轻度为步行、上楼时气短，可平卧，讲话可连续成句，呼吸频率轻度增加，呼吸末期有哮鸣音；中度为稍活动后出现气短，喜坐位，讲话以单词为主，时有焦虑或烦躁情绪，出汗，呼吸频率增加，可有辅助呼吸肌活动及三凹征，哮鸣音响亮、弥漫；重度为休息时出现气短，端坐呼吸，讲话以单字为主，常有焦虑、烦躁情绪，大汗淋漓，呼吸频率超过30次/分，常有辅助呼吸肌活动及三凹征，哮鸣音响亮、弥漫；危重为不能讲话，意识模糊或嗜睡，胸腹矛盾运动，哮鸣音减弱乃至无。以上判断标准只需符合某一程度的某项指标即可分级，无须满足全部指标。将研究组分为轻度组(33例)，中度组(22例)，重度组(34例)，危重组(31)例。选取同期在本院体检的健康人群120例为对照组，年龄20～59岁、平均(38.53±5.41)岁，男62例、女58例。对照组研究对象无长期慢性咳嗽、呼吸困难、气喘等哮喘类症状及病史，无个人过敏疾病史及过敏反应家族史。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有研究对象均同意本研究并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集 抽取两组研究对象肘静脉血5 mL，加入乙二胺四乙酸二钠进行抗凝，将标本放于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2基因组DNA提取 将标本取出，常温下放置1～2 h融解，取标本300 μL，加入细胞裂解液450 μL，封闭后用力震荡，充分混合后采用离心机(济南好来宝医疗器材有限公司，TGL-16M)以8 000 r/min离心3 min，取细胞核沉淀物，加入缓解液GS 200 μL，震荡至完全结合。样品中加入蛋白酶K溶液15 μL，采用涡旋机(广州思硕机电设备有限公司，OX-0.66/8)涡旋6 s，加入缓冲液GB 15 μL，摇晃充分后，放入65 ℃水浴锅(北京京创泰宁伟业科技发展有限公司，DZKW-A)恒温5 min，充分摇晃至溶液变清亮。加入70%乙醇溶液200 μL，充分摇晃至出现沉淀物，将沉淀物放置于离心管，8 000 r/min离心1 min，倒弃溶液，加入缓冲液GD 500 μL，8 000 r/min离心1 min，倒弃溶液，加入漂洗液PW 650 μL，8 000 r/min离心1 min，倒弃溶液，再加入漂洗液PW 500 μL，8 000 r/min离心1 min，倒弃溶液，再8 000 r/min离心3 min，倒弃溶液。于室温倒置离心管于滤纸上，晾干沉淀物，加入洗脱缓解液300 μL，轻微震荡，放置于37 ℃恒温水浴锅12 h，收集溶液，采用基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)提取基因组DNA。

1.2.3等位基因特异性聚合酶链反应(PCR) PCR反应体系20.0 μL：提取基因组DNA 1.0 μL，上、下游引物共0.32 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.1 μL，10×Buffer 2.0 μL，二甲基亚砜1.0 μL，荧光染料Rox 0.2 μL，荧光染料SYBR 0.2 μL，超纯净水13.18 μL，氯化镁(MgCl2) 0.4 μL。反应条件：变性，温度95 ℃，时间3 s；退火，温度95 ℃，时间15 s；延伸，温度60 ℃，时间45 s，35个循环；终末延伸，温度72 ℃，时间10 min。PCR产物扩增选择德国Eppendorf公司的实时荧光定量PCR系统，PCR产物长度为211 bp。上游引物：5′-CCCCAAGAAACTCAGTAAACG-3′；下游引物：5′-GAGAAATGGTGGAGGGTAAAT-3′。采用限制性内切酶NaR1进行T2位点检测，总体系为20.0 μL，其中10×Buffer 2.0 μL，去离子水7.0 μL，限制性内切酶1.0 μL，成功扩增的PCR产物10.0 μL。放置于37 ℃恒温箱过夜，逐一滴入2.5%琼脂糖凝胶梳孔，于电压槽80 W电压下进行电泳30 min，于凝胶成像仪保存后进行图片分析。

1.2.4DNA序列测定 采用遗传分析仪(北京中盾安民分析技术有限公司，GA118-16A)对扩增好的PCR产物进行测序，并采用NCBI的BLAST软件与数据库进行同源性分析，验证正确性。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理和分析。计数资料以例数或率表示，Hardy-Weinberg平衡定律检验、等位基因频率和组间基因型频率的比较采用χ2检验，ADAM33基因T2位点等位基因分布与支气管哮喘患病之间的关联、哮喘患者严重程度与其T2位点多态性的关系采用Logistic回归进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组ADAM33基因T2位点Hardy-Weinberg平衡定律检验 采用Hardy-Weinberg平衡定律检验公式χ2=(O-C)2/C计算ADAM33基因T2位点3种基因型(AA、AG、GG)χ2值，发现研究组和对照组ADAM33基因T2位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。见表1。

表1 两组ADAM33基因T2位点Hardy-Weinberg平衡定律的检验

2.2两组ADAM33基因T2位点基因型频率比较 研究组与对照组ADAM33基因T2位点基因型(AA、AG、GG)频率比较，差异均有统计学意义(χ2=7.001，P<0.05)。见表2。

表2 两组ADAM33基因T2位点基因型频率比较[n(%)]

2.3两组ADAM33基因T2位点等位基因频率分布比较 ADAM33基因T2位点等位基因频率分布比较中，研究组A等位基因频率(15.42%)低于对照组(23.75%)，差异有统计学意义(P<0.05)；Logistic回归分析结果提示，ADAM33基因T2位点A等位基因频率降低可提升支气管哮喘患病风险(OR=0.875；95%CI：0.758～0.920，范围包括1，P>0.05)。见表3。

表3 两组ADAM33基因T2位点等位基因频率分布[n(%)]

2.4支气管哮喘患者严重程度与ADAM33基因T2位点多态性的关系 轻度组患者ADAM33基因T2位点AG基因型频率(9.09%)低于中度组患者(36.36%)、重度组患者(32.35%)、危重组患者(41.94%)，差异有统计学意义(χ2=6.136、5.482、9.197，P<0.05)；中度组患者ADAM33基因T2位点AG基因型频率与重度组患者、危重组患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归分析结果显示，ADAM33基因T2位点AG基因型频率增加是影响支气管哮喘严重程度的高危因素(OR=1.581；95%CI：1.118～1.453；P<0.05)。见表4、5。

表4 支气管哮喘患者严重程度与ADAM33基因T2位点多态性的关系(n)

表5 影响支气管哮喘严重程度的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

支气管哮喘是由环境因素及遗传因素共同作用引起的气道慢性炎症。近年来，我国支气管哮喘发病率逐年增加，给患者、家属及社会带来沉重负担。大多数支气管哮喘患者经过吸入激素、支气管扩张剂等药物进行规范、足疗程的治疗可完全控制病情，但仍然有部分支气管哮喘患者病情难以控制，且病情迁延难愈，易复发。因此，研究支气管哮喘发病机制对该病的临床诊断及治疗具有重要意义[8-10]。当环境因素损伤正常气道时，气道会启动组织修复及炎性反应，然而，对支气管哮喘而言，患者对气道损伤的敏感度降低，支气管组织修复的效率较低，修复进程较慢，这加重了支气管哮喘患者气道炎性反应，以及促进了气道重构[11]。气道、血管和上皮平滑肌纤维增生，上皮下基底膜纤维化，气道气流受限是支气管哮喘患者常见的病理学改变，由此产生气道重塑和不可逆性狭窄[12-13]。支气管哮喘还受多基因遗传的影响，研究发现支气管哮喘的发生及发展与多种易感基因密切相关[14]。

近年发现的支气管哮喘易感基因为ADAM33基因，ADAM33丰富地表达于间质细胞及平滑肌细胞，较少表达于上皮细胞。ADAM33基因位于20号染色体短臂(20p13)，包含21个内含子和22个外显子，跨度为14 kb，ADAM33中包含813个氨基酸，通过内肽酶切割为成熟蛋白。ADAM33前体蛋白含有细胞内糖蛋白结构域、跨膜结构域、解整合素结构域、金属蛋白酶结构域等保守的结构域，通过这些结构域在信号传导、细胞融合、金属蛋白酶活性调控等方面起重要作用。研究表明，支气管哮喘患者肺功能下降及气道高反应性与ADAM33蛋白水解酶活性提升相关，ADAM33蛋白水解酶参与气道重塑和不可逆性狭窄等病理过程[15-17]。支气管哮喘主要是由于气道气流受阻、气道平滑肌纤维增生等，导致气道重塑和不可逆性狭窄，而ADAM33 mRNA在支气管平滑肌细胞、肌纤维母细胞、成纤维细胞中呈高表达状态，提示支气管哮喘患者气道重塑和不可逆性狭窄很可能与ADAM33基因有关[18]。PUXEDDU等[19]发现，ADAM33基因可促进血管生成，ADAM33基因是组织重塑基因，与气道重塑有关。

研究显示，ADAM33基因的单核苷酸多态性与支气管哮喘的遗传易感性有关，T2位点位于第20个外显子，第744个氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸，碱基改变是由A替代G，单核苷酸多态性存在连锁不平衡，ADAM33基因中的哪个单核苷酸多态性在支气管哮喘中起主导作用难以确定[20-22]。本研究对研究组和对照组ADAM33基因T2位点3种基因型进行Hardy-Weinberg平衡定律检验，结果均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，说明两组试验对象有很好的均衡性。研究组与对照组ADAM33基因T2位点基因型(AA、AG、GG)频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明ADAM33基因T2位点与支气管哮喘易感性有关。

JONGEPIER等[23]随访支气管哮喘患者20年，分析ADAM33基因的9种单核苷酸多态性对患者肺功能的影响，发现ADAM33基因不仅与支气管哮喘易感性有关，还与支气管哮喘患者疾病严重程度密切相关。本研究对危重、重度、中度、轻度支气管哮喘患者进行ADAM33基因T2位点基因型频率分析，结果显示，中度、重度、危重支气管哮喘患者ADAM33基因T2位点AG基因型频率高于轻度支气管哮喘患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示ADAM33基因T2位点AG基因型频率增加是影响支气管哮喘严重程度的高危因素(P<0.05)。ADAM33基因T2位点等位基因中，研究组A等位基因频率(15.42%)低于对照组(23.75%)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示ADAM33基因T2位点A等位基因频率增加可降低支气管哮喘患病风险(OR=0.875，P<0.05)。李晓等[24]对重度、中度、轻度支气管哮喘患者进行ADAM33基因T2位点基因型频率及基因分布分析，发现T2位点等位基因中，支气管哮喘患者A等位基因频率高于健康人群，重度和中度支气管哮喘患者AG基因型频率均高于轻度支气管哮喘患者，得出罹患支气管哮喘的高危因素是A等位基因频率增加，影响支气管哮喘严重程度的高危因素是AG基因型增加，与本研究结果有所不同。

综上所述，支气管哮喘与ADAM33基因位点多态性存在关联：ADAM33基因T2位点与支气管哮喘易感性有关，ADAM33基因T2位点A等位基因频率增加可降低支气管哮喘的患病风险，ADAM33基因T2位点AG基因型是影响支气管哮喘严重程度的高危因素。今后研究可选择更多位点探讨ADAM33基因单核苷酸多态性与支气管哮喘的关联，探讨其在支气管哮喘中的发病机制。