近红外光谱技术在微生物检测中的应用进展

田燕龙，王 毅，王 箫，高学军，周加才，陆道礼，陈 斌

1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013 2.北京京仪集团有限责任公司，北京 100022 3.北京北分瑞利分析仪器(集团)有限责任公司，北京市物质成分分析仪器工程技术研究中心、北京市企业技术中心，北京 100095

引 言

微生物是指一切肉眼看不见或看不清的微小生物，形体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚[1]。微生物种类繁多、数目庞大，主要包括放线菌、细菌、病毒、真菌、立克次体、支原体等。微生物无处不在，与人类生产生活有着十分密切的关系。人们每天吃的馒头、面包、泡菜等食品和喝的酸奶，以及各种酒类-调味品中的醋、酱油，都是经过微生物发酵制作出来的。但是微生物在人们日常生活中也有负作用。比如肉、蛋，水果等食物，如果保存不当，就会腐烂、变质；人类感染细菌和病毒等病原微生物后就会生病乃至死亡；药品生产过程中如果被有害微生物污染，其有效成分会遭到破坏，从而失去有效性。凡此种种、不胜枚举，为了防范和控制微生物的危害，微生物的快速、准确检测变得尤为重要。

目前常用的微生物检测技术，主要包括传统生化方法、色谱技术、显色培养基技术、链式反应检测技术、核酸探针检测技术、电阻抗检测技术和免疫分析检测技术等[2-3]。这些技术虽然检测准确度很高，但都存在一定的局限性，或者前处理步骤复杂、时间长、检测结果假阳性率偏高，或者仪器设备昂贵、对检测环境要求高，均不适合快速检测。因此探寻一种准确、简便、快捷的分析技术具重要意义。近红外光谱(NIRs)技术是指利用物质对近红外光的选择性吸收及其吸收强度来预测其成分和含量，主要用于有机物质定性和定量分析，具有操作简单、分析速度快、对检测人员专业要求低、分析过程无污染等优点，已广泛应用于农业、医药、食品等多个领域，在微生物检测领域也展现出巨大的应用潜力[4-5]。

1 近红外光谱技术鉴定微生物的基本原理

近红外光是指位于780～2 500 nm(12 820～4 000 cm-1)范围的电磁波，NIRs主要测量分子振动的倍频及合频吸收，包含了绝大多数类型有机物组成和分子结构的丰富信息。所有的生物系统都是由水、核酸、蛋白质、糖类和脂类组成的，其中的核酸(RNA和DNA)、蛋白质(多肽)、糖类和脂类是由分子量小于500的单体通过聚合作用形成的大分子，统称为生物大分子[6]。NIRs技术通过读取微生物菌体细胞壁、细胞膜及细胞内生物大分子和水的化学键振动情况，提供整个微生物菌体生化组成成分的光谱定性定量信息，因此可以区分生化信息上的差别[7-8]。此外，由于倍频与合频吸收强度弱、吸收带较宽且重叠严重，导致NIRs解析困难，必须结合化学计量学技术，才能实现对微生物的检测[9]。

2 近红外光谱技术在微生物研究中的应用

2.1 国外近红外光谱技术检测微生物的研究发展状况

2.1.1 微生物分类

马里兰大学帕克分校的Rodriguez-Saona等利用氧化铝多孔膜富集细菌，在光谱信息丰富的1 667～2 500 nm(6 000～4 000 cm-1)区域进行主成分分析(PCA)，最早用NIRs实现了大肠杆菌HB101、大肠杆菌ATCC 43888、大肠杆菌1224、淀粉酶样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、伊诺卡氏李斯特菌等细菌的鉴定[7-8,10]。在此基础上，他们又实现了NIRs对1×105CFU·mL-1浓度大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌等菌株的快速检测和鉴定[11]。

Alexandrakis等选择700～900 nm(14 286～11 111 cm-1)的波长范围进行建模，对英诺库亚氏李斯特菌FH、乳酸乳球菌、荧光假单胞菌、门多西纳假单胞菌、恶臭假单胞菌进行鉴别，发现偏最小二乘(PLS)方法能够实现菌属水平上5种细菌共127个样本100%的正确判别[12]。Feng等采用竞争性自适应重加权采样(CARS)技术，仅选择3个波长就实现了对浓度为1×109CFU·mL-1的大肠杆菌和因诺氏李斯特菌在菌种和菌株水平上的分类[13]。Sivakesava等分别使用傅里叶变换红外光谱(FT-IRs)和傅里叶变换近红外光谱(FT-NIRs)对5种不同微生物进行了鉴别，发现FT-NIRs的样品制备过程更加简单，但是在典型变量分析时需要更多的主成分数，而且只能在菌属水平上对5种微生物进行分类，不能在菌种水平上对5种微生物进行分类[14]。Krepelka等提出了一种FT-NIRs曲线拟合方法，该算法将光谱分解为特定的吸收峰，简化了光谱，提高了对细菌种类的预测能力[15]。Lima等利用FT-NIRs方法结合多元分析快速鉴别了产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和不产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌[16]。

2.1.2 食源性微生物检测

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，全球每年发生高达1.5亿的腹泻病例中，有70%是由各种致病性微生物污染食品所引起，因而快速、简便、特异的致病微生物检测方法成为研究热点[17]。

使用NIRs法可以实现对肉类腐败程度的检测[18-22]。Alexandrakis等利用NIRs和化学计量学检测和鉴定了接种在鸡胸肉上的选定细菌，发现NIRs可以检测和区分接种和未接种细菌的鸡胸肉，而且可以区分新鲜和不新鲜，但是却未能区分用于本研究接种的五种不同菌株[21]。Powell等在1 000～1 333 nm(10 000～7 500 cm-1)的光谱范围内，利用FT-NIRs方法实现了新鲜三文鱼鱼片与4 ℃保存9 d的鱼片的分离鉴别，并利用PLS回归预测模型，预测了9 d后的细菌数量，证明了NIRs检测和预测鱼类微生物腐败的可行性[22]。

NIRs还能够检测水果蔬菜中的微生物污染物[23-25]。有研究发现，FT-NIRs方法在1 111～2 000 nm(9 000～5 000 cm-1)范围内可用于菠萝果肉中1×108CFU·mL-1浓度水平大肠杆菌和肠炎链球菌的鉴别，认为该技术在食品中污染物的检测方面具有很大的潜力[23]。在700～1 100 nm(14 286～9 091 cm-1)短波区域内，NIRs也被证明是一种快速、无损检测卷心菜细菌污染的方法[24-25]。

此外，Cámara-Martos等使用FT-NIRs方法实现了对水基食品基质中的乳酸菌以及牛奶中的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的鉴定和定量[26-27]。Daskalov等发现NIRs可以成功区分保加利亚黄色奶酪是否被低浓度(1×101×103CFU·g-1)的单核增生李斯特菌污染[28]。Al-Qadiri利用短波NIRs技术，将光谱特征的变化与细菌增殖和牛奶腐败程度相关联，实现了快速、无创地检测和监测牛奶腐败[29]。

2.1.3 粮食中产毒真菌检测

据联合国粮农组织调查估算，全球每年受真菌毒素的污染的粮食约有25%。因污染严重而失去商业价值的农作物约有2%，利用NIRs可以实现对产毒真菌的快速检测[30-34]。Berardo等采用NIRs法快速检测了玉米籽粒的腐败和霉菌毒素，发现NIRs可以准确预测真菌侵染果仁的发生率，特别是黄萎病菌侵染果仁的发生率，以及膳食中麦角甾醇和富马菌素B1的含量[31]。Gaspardo等研究发现FT-NIRs方法是检测玉米粉中富马菌素B1和B2的一种较好的方法，可用于安全食品和污染食品的鉴别[32]。Tao等使用CARS-PLS模型对黄曲霉毒素污染玉米粒和健康玉米粒进行了分类，当阈值为20和100 ppm时分类的总体准确率分别达到86.67%和84.44%[33]。Fernández-Ibaez等分别使用FT-NIRs仪器和色散型NIRs仪器测试了玉米和大麦籽粒中的黄曲霉毒素B1，发现在FT-NIRs仪器上建立的校正模型可以获得更好的光谱信息，无需数学预处理就能得到较好的统计结果[34]。

2.1.4 近红外光谱成像微生物检测

运用常规的NIRs技术得到的是样品某一点(或区域)的平均光谱，因而是样品组成或性质的平均结果。利用NIRs成像技术则可以实现样品空间各点的信息，从而进一步得到空间各点的组成和结构信息[35]。Dubois等利用近红外化学成像技术分别在1 000～2 350 nm(10 000～4 255 cm-1)和1 200～2 400 nm(8 333～4 167 cm-1)的光谱范围内对沉积在特制抛光铝卡片上的细菌细胞进行了高通量分析[36-37]。结果表明，通过分析特定波长的强度差异可以来识别细菌，并且可以使用离散波长来区分和识别卡片中包含的各种生物体。Sun等利用高光谱成像技术先后快速测定了鸡胸肉中假单胞菌和肠杆菌含量以及三文鱼肉中乳酸菌的腐败，证明近红外高光谱成像技术是一种不需要复杂的实验室条件就能确定食品卫生和检测食品基质上致病菌的潜在工具[38-40]。Kimmies等利用近红外高光谱成像和多元数据分析对食源性细菌进行鉴别，成功分离了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并实现了颜色相似细菌的区分和致病菌与非致病菌的区分[41]。

2.1.5 其他微生物检测

除了上述应用外，NIRs技术在微生物检测领域还有一些其他的应用。Quintelas等在1 667～1 852 nm(6 000～5 400 cm-1)的光谱区域内使用FT-NIRs技术对药品中的细菌污染进行了检测和定量，结果表明在3种药物制剂(隐形眼镜液、止咳糖浆和主题消炎液)中，FT-NIRs能够对所有细菌的无菌溶液和污染溶液进行鉴别，对枯草杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、肠沙门氏菌、表皮葡萄球菌的检测限分别为9.0，5.1，5.7，7.8和5.7 CFU·mL-1[42]。铜绿假单胞菌是医院感染的主要原因，并且在治疗的3～4 d后就会产生耐药性，Marques等利用线性判别分析(LDA)和遗传算法(GA)对铜绿假单胞菌进行FT-NIRs分析，根据耐药和敏感性实现了对临床标本中铜绿假单胞菌的分离[43]。Sikulu-Lord等利用NIRs检测和鉴定了实验室饲养的雄性和雌性埃及伊蚊中两种沃尔巴克氏体菌株(wMelPop和wMel)，发现NIRs可以将感染wMelPop和wMel的埃及伊蚊与未感染的野生样本区分开，鉴别准确率最低也达到了84.5%[44]。此外，Pesala等利用红外光谱和NIRs对结核分枝杆菌进行无创检测；Saranwong等设计了一种生牛奶化学成分和总需氧菌计数的无损近红外光谱分析系统[45]。

2.2 国内近红外微生物检测研究发展状况

和国外相比，国内关于NIRs微生物检测的研究起步较晚，2008年刘建学等使用NIRs快速预测了原料乳中大肠菌群[46]。目前国内关于NIRs微生物检测的文献主要集中在不同细菌分类、食源性致病菌检测以及粮食中产毒真菌检测等三方面。

2.2.1 微生物分类

河南科技大学的刘建学等在基于NIRs技术的细菌分型和鉴别方面做了大量工作。该课题组利用基于PCA的投影判别技术，检测和识别了大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌，54个样本的判别正确率达到100%[47]；以NIRs结合支持向量机(SVM)实现了对大肠杆菌O157∶H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌(90个样本)的100%分类鉴别[48]；采用改进的贝叶斯判别模型(BDA)实现了对大肠埃希氏菌0157∶H7、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌3种细菌(80个样本)100%的正确分类[49]。最近，马凯旋等研究了大肠埃希氏菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌3种致病菌的不同浓度和不同培养阶段的光谱数据，发现在10 CFU·mL-1的低浓度下仍然能够实现对细菌的识别；此外在对致病菌检测时，应对样品的前处理进行统一，以提高鉴别的准确度[50]。

西北农林科技大学的相关研究通过采集1株酵母和5株细菌标准菌株的近红外漫反射光谱，在1 852～2 500 nm(5 400～4 000 cm-1)的光谱范围内采用PCA对光谱数据进行了分析，构建了基于FT-NIRs的微生物快速鉴定模型，这是国内较早进行的基于NIRs技术的细菌分型和鉴别工作。随后，该课题组又基于FT-NIRs技术实现了脂环酸芽孢杆菌种间的分类鉴定。

第三军医大学马宁等进行了NIRs鉴别耐甲氧西林金葡菌和甲氧西林敏感金葡菌的研究，发现在900～2 200 nm(11 111～4 545 cm-1)光谱范围内使用NIRs结合SVM的分析方法具有精确区分耐甲氧西林金葡菌和甲氧西林敏感金葡菌的能力[51]。Mu等研究了FT-NIRs技术在不同菌种中对单个菌株进行分类的潜力，结果表明，SVM和径向基函数神经网络(RBF)等非线性分类方法的分类正确率均在96%以上，优于PLS判别分析[52]。福州大学的相关研究使用FT-NIRs技术对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌进行鉴别，结果表明反向传播神经网络(BP-ANN)算法具有最佳预测效果，预测集60个样品的预测精度达到100%。

最近，江苏大学Shi等研究了利用NIRs特征结合化学计量学快速鉴定乳酸菌种类的可行性，发现当选取10个特征波数(4 119，4 428，4 316，4 914，5 905，6 193，6 526，6 969，8 373和8 659 cm-1)时，利用最小二乘支持向量机(LS-SVM)可以建立最优识别模型，对实验中所用的4个菌种11个菌株的识别率在80%～95%之间[53]。

2.2.2 食源性微生物检测

中国海洋大学相关研究针对鱼类在低温贮藏过程中的微生物变化，利用便携式NIRs仪器结合GA和BP-ANN系统方法建立了三文鱼和比目鱼菌落总数的预测和检测模型[58-59]。三文鱼模型与传统平板计数方法的相关系数为0.981，均方根误差为0.097，验证模型的相关系数为0.960，均方根误差为0.098；比目鱼模型与传统平板计数方法的相关系数为0.985，均方根误差为0.095，验证模型的相关系数为0.966，均方根误差为0.083，两种模型都具有良好精密度和准确度。

有研究利用FT-NIRs技术快速、准确、无损地识别了鸡肉中分离的4种致腐假单胞菌单菌种及其混合菌种菌液，从而实现了鸡肉中假单胞菌的NIRs快速识别[56]。浙江工商大学曹海燕等利用FT-NIRs结合PLS、马氏距离等分析方法实现了对紫薯半干面新鲜程度的鉴别以及紫薯半干面中菌落总数含量的定量检测，其中检测紫薯半干面菌落总数含量范围为40～1×108CFU·g-1，已经可以满足行业标准NY/T 1512—2007《绿色食品 生面食、米粉制品》中菌落总数(≤3×105CFU·g-1)的检测要求[57]。

2.2.3 粮食中产毒真菌检测

东北农业大学的张强等基于SVM进行了稻谷黄曲霉毒素B1的NIRs无损检测研究，所建模型的校正集决定系数达到0.913，表明NIRs可准确检测稻谷中的黄曲霉毒素B1[58]。基于多元线性回归(MLR)和逐步回归算法(SRA)，他们又构建了基于NIRs的稻谷霉菌和毒素检测数学模型，实现了稻谷表面霉菌菌落总数的快速预测[59]。中国农业大学的袁莹等利用FT-NIRs对霉变玉米进行了检测，SVM分类模型对训练集和测试集的预测准确率分别达到93.3%和91.7%[60]。相关研究利用PCA，LDA和PLSR方法建立了稻谷霉菌污染的快速分析模型，该模型不仅可以用于感染不同霉菌稻谷样品的快速鉴别，还可有效区分不同霉变程度的稻谷。

利用NIRs技术还可以检测花生的真菌病害。有研究开发了一种基于NIRs技术的花生产毒霉菌污染程度的定性定量分析方法，对储藏0，3，6和9 d花生的感染单一霉菌和多种霉菌的总体判别正确率分别达到100%和99.17%。江苏大学的黄星奕等建立了一种基于FT-NIRs技术和K最近邻(KNN)模式识别方法的霉变和出芽花生识别方法，训练集与预测集识别率均为98.84%[61]。

3 结论和展望

NIRs技术作为一种新型的分析技术，目前已经可以实现10 CFU·mL-1的极低浓度水平下食源性致病菌的检测[28,50,57]，满足部分食品安全国家或行业标准中100 CFU·mL-1(CFU·g-1)微生物限量的检测需求，在食品安全领域具有广阔的应用前景。NIRs技术结合化学计量学软件可以实现食品生产和加工中微生物的在线检测，缩短检测时间，提高生产效率。NIRs用于微生物鉴别和分类时，在将来的临床检测中，可以节约大量的人力、物力和财力，并为寻找合适的抗菌药物提供了依据，缩短对病人的确诊时间，减缓病人的痛苦。

然而，开展NIRs技术在微生物检测领域的应用研究，还任重而道远。(1)必须制定规范化和标准化的样品制备和操作流程，这样才能实现不同微生物实验室的数据互通和实验重现性，进而实现NIRs技术在微生物检测领域的大规模应用；(2)目前还没有一个成熟的关于微生物检测的NIRs模型数据库，而NIRs定性和定量分析几乎完全依赖于数据库；(3)由于传统红外仪器设计理念的问题，处于近红外和中红外结合区域的2 000～3 000 nm(5 000～3 333 cm-1)范围的电磁波，FT-NIRs仪器和FT-IRs仪器在这一区域受到光源种类、分光器件基础材料、探测器类型等诸多因素的影响，仪器的信噪比都非常低，而2 000 nm以上波长区域恰恰是生物大分子光谱信息最丰富的区域，因此如果有专门针对这一波段优化设计的光谱仪器，相信会有助于微生物的定性和定量分析。