滋肾通关方中肉桂反佐配伍对黄柏-知母药对在大鼠体内活性成分组织分布的影响*

孙蕾，王迅，赵晨光，刘月恒，刘顺

（江苏省中医院·南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210036）

反佐配伍是一种独特的中医遣方组药，通过“药性相反、药效协同”的组方理论实现药性与病性相趋、因势利导、相反相成的独特配伍方式。左金丸、吴茱萸汤、交泰丸、通关丸等均是反佐配伍的经典方剂。滋肾通关胶囊是江苏省中医院基于《兰室秘藏》所载“通关丸”开发的医院制剂，用于治疗肾虚湿热淋证之热蕴膀胱所致尿闭不通、小腹胀满、尿道涩通等症，疗效较好［1-2］。目前对滋肾通关方机理的认识还不足，对组成较简单的复方、药对的研究大多是针对化学成分的含量和变化、药理作用等方面，而对药对配伍前后尤其反佐配伍前后药对的活性成分在动物体内的组织分布研究较少。故本课题采用已建立的超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）法［3］，以黄柏-知母药对及药对配伍肉桂后的滋肾通关方为研究对象，通过比较药对中的代表性成分黄柏碱和知母皂苷AⅢ在正常大鼠心、肝、脾、肺、肾组织中分布的差异，探讨肉桂反佐配伍的作用机制。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

仪器：ThermoFisher TSQ Quantum Access MAX型三重四极杆质谱仪（配有电喷雾离子源、Xcalibar 1.4工作站、LC Quan数据处理软件），Dionex型超高效液相色谱系统（配有二元输液泵、自动进样器），均购自美国Thermo Scientific公司；Milli-Q Gradient A10型超纯水器（美国Millipore公司）；VORTEX-GENIE 2型漩涡仪（美国Scientific Industries公司）；PCB-11型振荡仪，Eppendorf Centrifuge 5430R型冷冻高速离心机，均购自德国Eppendorf公司；BP 211D型电子分析天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）；Centrivap Concentrator/Cold Trap型高速冷冻离心浓缩仪（美国Labconco公司）；FLuKO F6/10型手持组织匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；可调移液器［百得实验仪器有限公司（2～20µL和20～200µL），德国Eppendorf公司（100～1 000µL）］。

试药：知母皂苷AⅢ对照品（批号为Y27A6Y17282），黄柏碱对照品（批号为H24F3X1），氢溴酸右美沙芬-水合物对照品（批号为F26M7E11810），薯蓣皂苷对照品（批号为P20J7F18116），均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度不低于98%；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；其余试剂均为分析纯；黄柏（马鞍山井泉中药饮片有限公司，批号为20170201）；知母（贵州同德药业有限公司，批号为20161101）；肉桂（安徽大别山中药饮片公司，批号为160803）；滋肾通关方和黄柏-知母药对混悬液（自制）。

动物：健康Wistar大鼠56只，SPF级，体质量180～200 g，雌雄各半，由扬州大学比较医学中心提供，动物许可证号为SCXK（苏）-2017-0007。饲养温度为（24±1）℃，相对湿度为50%～60%。

2 方法与结果

2.1 样品制备

按方中知母、黄柏、肉桂比例10∶10∶1（m/m/m）称配，打粉，加生理盐水配制成按饮片量计质量浓度为1 g/mL的滋肾通关方混悬液，置4℃温度下储存，临用时混匀。分别取黄柏和知母饮片，按滋肾通关方中比例10∶10（m/m）称配，打粉，加生理盐水配制成按饮片量计质量浓度为1 g/mL的黄柏-知母药对混悬液，置4℃温度下储存，临用时混匀。

2.2 分组及给药

取健康Wistar大鼠56只适应喂养1周后，随机分为空白组，滋肾通关方低、中、高剂量组，黄柏-知母药对低、中、高剂量组，各8只，雌雄各半。滋肾通关方临床等效剂量为10 g/kg，低、中、高剂量分别5，10，20 g/kg。空白组，滋肾通关方低、中、高剂量组，黄柏-知母药对低、中、高剂量组分别灌胃相应量的生理盐水、滋肾通关方混悬液、黄柏-知母药对混悬液，给药前禁食12 h，自由饮水。

2.3 组织样品处理［4-6］

给药后1 h处死大鼠，迅速取出心、肝、肺、肾、脾组织，用生理盐水洗去组织表面血迹及内容物，并用滤纸吸干，即得各组织样品。取各组织样品，精密称定，按1 g∶5 mL的比例加入预冷（4℃）的生理盐水，制成20%的组织匀浆液。取200 µL组织匀浆液，分别加入质量浓度为11.11 µg/mL和7.01 µg/mL的右美沙芬及薯蓣皂苷混合内标液15 µL，混匀，再加入1 mL乙腈，涡旋振荡（转速为2 000 r/min）5 min，离心（转速为16 000 r/min）5 min，取上层有机相置另一离心管中，45℃温度下挥干溶剂，加入100 µL初始流动相复溶残留物，涡旋混匀（转速为2 000 r/min）5 min，离心（16 000 r/min，温度为10℃）10 min，取上清液，备用。

2.4 黄柏碱和知母皂苷AⅢ含量测定

2.4.1 测定条件

1）色谱条件。色谱柱：预柱Kromasil 100-3.5 C18柱，色谱柱Kromasil 100-3.5 C18柱（150 mm×2.1 mm，100Å）；流动相：0.2%甲酸水溶液（A）-纯乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min时75%A，1～4 min时75%A～10%A，4～9 min时10%A，9～9.8 min时10%A～75%A，9.8～13 min时75%A）；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃；自动进样：温度为8℃，进样量为5µL。

2）质谱条件。离子化方式采用电喷雾离子源（ESI），选择多反应监测离子扫描模式（MRM）。主要扫描参数：喷雾电压为3 000 eV（-）和4 000 eV（+）；毛细管温度为270℃，雾化温度为200℃；鞘气（N2）压力为20 psi，辅助气压为5 psi；正、负离子模式同时检测；放电电流为4.0µA（正极）和4.0µA（负极）。

2.4.2 溶液制备

取黄柏碱和知母皂苷AⅢ对照品各适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含黄柏碱721.28 µg、知母皂苷AⅢ559.44µg的混合对照品溶液。取氢溴酸右美沙芬-水合物和薯蓣皂苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含右美沙芬11.11µg、薯蓣皂苷7.01µg的混合内标溶液。

2.4.3方法学考察

专属性试验：吸取空白心、肝、脾、肺、肾组织匀浆液，分别加入2.4.2项下混合对照品溶液和混合内标溶液，按2.3项下方法处理后进行UHPLC-MS/MS分析。色谱图见图1。黄柏碱和知母皂苷AⅢ与2个内标都能同时被检测到，且色谱峰峰形良好，各组织匀浆液中的内源性成分不干扰待测物和内标的测定，表明组织处理方法及测定条件的专属性均良好。

线性关系考察及检测限确定：取2.4.2项下混合对照品溶液逐级稀释，依次精密吸取10µL各对照品稀释液、混合内标溶液，置100µL空白肝组织匀浆液中，制成每1 mL含黄柏碱18.032，36.064，288.512，721.280，1 442.560，3 606.400，7 212.800 ng和含知母皂苷AⅢ13.986，27.972，223.776，559.440，1 118.880，2 797.200，5 594.400 ng的标准品稀释液，按2.4.1项下试验条件检测，以待测物质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、对照品峰面积与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标进行线性回归，得肝脏组织的标准曲线；以信噪比（S/N）为3∶1时的质量浓度确定检测限。结果见表1。

表1 黄柏碱和知母皂苷AⅢ在肝组织匀浆液中的线性关系考察结果及检测限Tab.1 Results of the linear relation test and limit of detection of phellodendrine and timosaponin AⅢin liver tissue homogenate

精密度和准确度试验：取心、肝、脾、肺、肾空白组织匀浆液，加入黄柏碱对照品和知母皂苷AⅢ对照品，分别配制成黄柏碱低、中、高质量浓度分别为72.128，144.256，1 442.560 ng/mL和知母皂苷AⅢ低、中、高质量浓度分别为55.944，111.888，1 118.880 ng/mL的样品溶液，每个浓度平行5份，按2.4.1项下试验条件测定，以当日的标准曲线计算其浓度，连续测定3 d，计算各组织样品中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的浓度，并与配制浓度对照，求得测定方法的准确度和日间精密度。结果黄柏碱和知母皂苷AⅢ在各组织匀浆液中日间精密度的RSD小于15%（n=15），准确度在±15%范围内，表明方法的准确度和日间精密度均良好。

基质效应考察：基质效应的考察可用来衡量样品前处理方法的可行性与准确性。取精密度试验项下低、中、高质量浓度样品溶液，按2.3项下方法处理，按2.4.1项下试验条件检测，以峰面积内标法定量分析黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量（A）；以纯水代替心、肝、脾、肺、肾空白组织匀浆液，同法考察样品中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量（C），各浓度平行操作5份，按公式计算基质效应，基质效应（%）=A/C×100%。结果见表2。

表2 黄柏碱和知母皂苷AⅢ在各组织匀浆液中的基质效应（n=5）Tab.2 Matrix effects of phellodendrine and timosaponin AⅢin homogenates of various tissues（n=5）

1.黄柏碱2.右美沙芬3.知母皂苷AⅢ4.薯蓣皂苷A.心组织B.肝组织C.脾组织D.肺组织E.肾组织图1超高效液相色谱串联质谱图1.Phellodendrine 2.Dextromethorphan 3.Timosaponin AⅢ4.DioscinA.Heart tissue B.Liver tissue C.Spleen tissue D.Lung tissue E.Kidney tissueFig.1 Chromatograms of UHPLC-MS/MS

稳定性试验：取精密度试验项下低、中、高质量浓度样品溶液，分别于常温下放置0，2，4，8，12，24 h时按2.4.1项下试验条件检测。结果不同质量浓度各成分含量的RSD均小于15%（n=6），表明大鼠心、肝、脾、肺、肾组织匀浆液中黄柏碱和知母皂苷AⅢ常温下24 h内稳定性良好。

提取回收率考察：取心、肝、脾、肺、肾空白组织匀浆液200 µL，分别加入20 µL精密度试验项下含黄柏碱、知母皂苷AⅢ低、中、高质量浓度的样品溶液，按2.3项下方法处理，按2.4.1项下试验条件检测，以峰面积内标法定量分析黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量（B）；以纯水代替心、肝、脾、肺、肾空白组织匀浆液，同法计算样品中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量（C）。各质量浓度平行操作5份，按公式计算提取回收率，提取回收率（%）=B/C×100%。结果见表3。

表3 黄柏碱和知母皂苷AⅢ在各组织匀浆液中的提取回收率（n=5）Tab.3 Extraction recovery rates of phellodendrine and timosaponin AⅢin homogenates of various tissues（n=5）

2.5 组织分布考察

按2.2项下方法分组并给药1 h后，取大鼠肝、心、脾、肺、肾组织，按2.3项下方法处理，按2.4.1项下试验条件检测，结果见图2和图3。可见，除灌胃高、低剂量滋肾通关方组大鼠脾组织匀浆液中黄柏碱的含量低于黄柏-知母药对组外，灌胃其余各剂量滋肾通关方组大鼠中各组织匀浆液中黄柏碱的含量均高于黄柏-知母药对组，并以肺组织匀浆液中的黄柏碱含量差异最显著（P＜0.05）；知母皂苷AⅢ主要分布在肝、肺组织中，其组织浓度除中剂量给药后的心、脾组织匀浆液及低剂量给药后的的脾组织匀浆液外，其余均为滋肾通关方组高于黄柏-知母药对组，其中以肝、肺组织中知母皂苷AⅢ含量差异最显著（P＜0.05）。结果显示，灌胃低、中、高剂量滋肾通关方和黄柏-知母药对混悬液1 h后，黄柏碱和知母皂苷AⅢ在肝、心、脾、肺、肾中均有分布，但大鼠灌胃黄柏-知母药对后在其组织中的黄柏碱和知母皂苷AⅢ含量整体低于相同灌胃量配伍肉桂的滋肾通关方组。

3 讨论

黄柏中的黄柏碱属异阿朴啡型生物碱，知母中的知母皂苷AⅢ属螺甾皂苷类成分。由图2和图3可知，大鼠灌胃给药黄柏-知母药对和滋肾通关方后，黄柏碱和知母皂苷AⅢ活性成分能在大鼠体内广泛分布，在心、肝、脾、肺、肾等组织/器官中均可检测出，其中在肝、肺、肾等组织中分布相对较多。可能是由于这些组织血流量丰富，通透性好，且肝是主要代谢器官，肾是主要排泄器官，是药物经过的必要场所。同时，与中医归经理论的知母归肺、胃、肾经，黄柏归肾、膀胱经，肉桂归肾、脾、心、肝经有一定程度的契合。

黄柏-知母药对灌胃后在大鼠组织中的黄柏碱和知母皂苷AⅢ含量低于相同灌胃量配伍肉桂的滋肾通关方组，表明黄柏-知母药对配伍少量肉桂可促进黄柏和知母活性成分在组织中的分布，可能是药对反佐配伍肉桂后改变了黄柏-知母药对中活性成分的跨膜转运，促进了活性成分在细胞器官内的吸收，直接影响活性成分的分布。

A.高剂量（20 g/kg）B.中剂量（10 g/kg）C.低剂量（5 g/kg）注：与滋肾通关方组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。H为黄柏-知母药对，Z为滋肾通关方。图3同。图2灌胃高、中、低剂量药物的大鼠体内组织匀浆液中黄柏碱含量A.High dose（20 g/kg）B.Medium dose（10 g/kg）C.Low dose（5 g/kg）Note：Compared with those in the Zishen Tongguan Recipe groups，*P＜0.05，**P＜0.01.H refers to Phellodendri Chinensis Cortex-Anemarrhenae Rhizoma herb pair，and Z refers to Zishen Tongguan Recipe（for Fig.2-3）.Fig.2 Contents of phellodendrine in tissue homogenates of rats after the administration of high-，medium-and low-dose of drugs by gavage

A.高剂量（20 g/kg）B.中剂量（10 g/kg）C.低剂量（5 g/kg）图3灌胃高、中、低剂量药物的大鼠体内组织匀浆液中知母皂苷AⅢ含量A.High dose（20 g/kg）B.Medium dose（10 g/kg）C.Low dose（5 g/kg）Fig.3 Contents of timosaponin AⅢin tissue homogenates of rats after the administration of high-，medium-and low-dose of drugs by gavage

本研究中采用UHPLC-MS/MS法定量分析了大鼠组织匀浆液中的黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量，初步比较了黄柏-知母药对及配伍肉桂的滋肾通关方的代表性成分在大鼠体内组织分布的规律和特征。黄柏、知母中的代表性成分在组织的分布中有一定变化，但不十分明显。配伍是否能改变药效物质基础的分布，可通过增加考察其他代表性成分、增加样本量、增加取样时间点、或通过进一步的药理学实验加以全面探究。