Keap1-Nrf2/ARE信号通路介导的昆虫抗药性机制的研究进展

曾苑芳，来有鹏

(1.青海大学，青海 西宁 810016；2.青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁 810016)

氧化应激(oxidative stress)是指生物有机体在受到各种有害刺激时，体内的高分子化合物如活性氧(ROS)和活性氮(RNS)产生过多，导致氧化与抗氧化作用之间的失衡，引起细胞和组织的生理和病理变化[1]。昆虫为了在各种环境和细胞压力下生存，已经进化出了强大的细胞防御系统来保护自己免受氧化应激和亲电压力，通过许多抗氧化酶和解毒酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)等来减轻细胞损伤[2-3]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein-1，Keap1)-核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路是抵御细胞氧化应激和异生物质反应的关键通路[4]。该信号通路调控的下游靶蛋白主要分为Ⅱ相代谢酶、抗氧化蛋白酶、蛋白酶体/分子伴侣、抗炎因子以及Ⅲ相代谢酶。研究表明Keap1-Nrf2/ARE信号通路与昆虫抗药性的产生有着密切的联系[5-8]。

长期以来，由于大量和高频次的使用杀虫剂，许多害虫对杀虫剂产生了不同程度的抗药性，导致部分杀虫剂失效。据统计，已有600多种昆虫对杀虫剂产生了抗药性，成为害虫防治的一大痛点[9]。昆虫的抗性机制主要包括代谢抗性、靶标抗性、表皮抗性和行为抗性[10]。其中代谢抗性是指昆虫体内酶过表达或构象改变，导致解毒酶活性升高，从而加速杀虫剂的代谢而产生的抗药性。细胞色素P450酶系(P450s)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)是昆虫体内主要的解毒酶系。

1 Keap1-Nrf2/ARE信号通路基本结构

Nrf2最初由Moi等人在血红素诱导的红系K562细胞中发现，分子质量为66ku，和果蝇的CNC(Cap‘N’Collar)家族同源，属于碱性亮氨酸拉链结构的转录因子(bZip)[11-12]。Nrf2有7个功能结构域，Neh1-Neh7。Neh1包含一个C端亮氨酸b-zip结构域，可与细胞核内的小Maf蛋白形成异二聚体，用于识别并结合ARE调控元件，从而启动目标基因的转录。Neh2包含DLG和ETEG两个结构域，是胞浆蛋白Keap1的结合区[13]。Neh3位于羧基端，与CHD6结合可上调Nrf2靶基因的转录[14]。Neh4和Neh5参与下游转录激活，Nrf2-Maf与ARE结合后需借助辅助蛋白与这两个结构域结合才能启动转录过程[15]。Neh6能与β-TrcP位点结合，调节Nrf2的降解[16]。RXRa与Nhe7结构域结合会抑制下游的基因表达[17]。

Keap1蛋白是一种多区域阻遏蛋白，与果蝇肌动蛋白结合蛋白KELCH高度同源，分子质量为69ku，是Nrf2的负调节器，通常锚定于胞浆肌动蛋白的细胞骨架上[13]。Keap1有5个功能结构域，分别为N端区域、BTB区域、中间连接区域、KELCH区域和C端区域。BTB区域附于Actin结合蛋白上，与Keap1蛋白的二聚化有关，Ser104位点的突变会影响Keap1的二聚化[18]。KELCH区域具有多个蛋白接触点，是Nrf2和Keap1的结合位点。中间连接区域含有半胱氨酸残基，是Keap1与亲电子化合物及氧化剂结合反应的区域，对氧化和核输出信号敏感。

ARE位于编码解毒酶和细胞保护蛋白基因的上游，是一种包含特定DNA序列的调节元件，具有功能活性的区域长度为16个核苷酸序列：5’-T(A/C)ANN(A/G)TGA(C/T)NNNGC(A/G)-3’。当生物体处于氧化应激状态时，Nrf2激活进入细胞核与Maf蛋白结合形成异二聚体，然后与ARE调控元件结合，启动下游多种基因的表达。

2 Keap1-Nrf2/ARE信号通路调控下游代谢酶

借助双元基因表达技术(GAL4/UAS)、基因干扰技术(RNAi)和基因编辑技术(CRISPR/Cas9)等来剖析昆虫外源性解毒机制，已经成为当前研究昆虫抗药性机制的一种有利手段。目前，许多通路已被证明参与了解毒基因的转录调控，与昆虫抗药性的形成有关，如GPCRs、MAPK-CREB、AhR/ARNT、HR96和Nrf2/ARE信号通路，其中Keap1-Nrf2/ARE信号通路是近几年的研究热点。Misra早期研究显示，PB调节的一半以上基因受CncC控制，CncC的表达也会引起这些基因的上调，利用GAL4/USA系统对过表达的Keap1进行测试，证明了CncC/Keap1通路的激活会影响马拉硫磷抗性的产生。进一步对果蝇的抗性菌株91R和RDDTR解毒基因表达机制进行研究，CncC/Keap1通路的构成性激活，会诱导多个解毒酶基因的过表达[8]。证明了CncC/Keap1通路在调节外源性解毒反应中起着核心作用[19]。

P450s是一类在真核细胞中普遍存在的超基因家族酶系，在昆虫外源性物质解毒方面发挥着重要的作用。目前，从昆虫体内克隆出的P450基因有CYP4、CYP6、CYP9和CYP18，其中CYP6家族被认为与昆虫抗药性的产生有关。有记录显示P450s家族参与了拟除虫菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、吡虫啉、烯啶虫胺、茚虫威等多种杀虫剂抗药性的形成，并且部分基因受到了Keap1-Nrf2/ARE信号通路的调控。Mohammed等报道，岗比亚按蚊CYP6M2启动子中存在Nrf2/Keap1和AhR/ARNT的结合位点TFBS，推测这两个通路可能调控了杀虫剂抗性基因CYP6M2的上调[20]。Peng等用棉酚对棉蚜处理后，其体内的CYP6DA2基因的活性显著增加，RNAi干扰CYP6DA2基因后，显著增加了棉酚对棉蚜的毒性，同时与对照相比，CncC、CYP6DA2的转录水平显著降低，因此CncC可能调控了CYP6DA2基因的表达[21]。Kalsi也报道了对拟除虫菊酯产生抗药性的赤拟谷盗QTC279品系体内CYP6BQ9基因上调与CncC/Maf的调控有密切联系，并证明了其结合位点[22]。后进一步敲除CncC基因，采用序列差异表达分析，QTC279品系中有662个基因表达下调，91个基因表达上调，并鉴定出了其中16个P450s基因受CncC调控，分别属于CYP3、CYP4、CYP6和CYP9基因家族[23]。此外对溴氰菊酯产生抗药性的基因进行研究，Keap1过表达，Cyp4e3、Cyp4d20、Cyp301a1、Cyp4g1、Cyp28c1、Cyp4ae1、Cyp4p2基因出现下调现象[7]。在斜纹夜蛾体内也报道了过表达的CYP321A16和CYP332A1基因受CncC/Maf通路的调控[24]。

GSTs是一类多功能的超家族酶系，广泛分布于生物体内[25]。主要通过催化还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基与有毒的亲电子化合物发生共价轭合反应，将毒性物质排出体外，是细胞解毒过程中的关键酶[26]。Cheng等报道用辛硫磷对家蚕处理24h后，其体内的解毒酶基因P450s、GSTs和CarE的表达量增加，同时检测到PI3K/Akt通路和CncC/Keap1通路的关键基因上调[27]。氯虫苯甲酰胺和吡丙醚处理家蚕后，也出现了同样的情况，证明了PI3K/Akt/CncC通路参与了这些解毒酶基因的调控[28-29]。Hu等对甜菜夜蛾的31个胞质GSTs基因进行了克隆，分析了其生物信息学和基因表达模式，其中7个SeGSTs基因显著表达，均含有CncC/Maf通路的结合位点，pGL3-SeGST启动子结构在接触杀虫剂后活性增强，表明了CncC/Maf通路调控了不同杀虫剂对甜菜夜蛾GST基因的共表达[30]。又进一步鉴定了三个对毒死蜱和氯氰菊酯抗性有关的GST基因，CncC、Maf、AhR和ARNT蛋白在GSTe6启动子的驱动下荧光素酶活性增加，在HZ16菌株中过表达，表明了CncC/Maf和AhR/ARNT协同调控了多条GST基因的表达，这些基因参与了甜菜夜蛾的杀虫剂抗性[31]。其它解毒酶和抗氧化酶也有相关的报道。Pan等对Sf9细胞和草地贪夜蛾幼虫中的SfCncC基因进行RNAi处理，显著降低了SOD基因的转录水平和活性[32]。Xu等也报道了敲除TcSULT1基因，能显著增加赤拟谷盗对溴氰菊酯的敏感性，RNAi和双荧光素酶测定均显示转录因子TcCncC调节TcSULT1基因的表达[33]。

目前已有少许报道，抗氧化剂可能参与Keap1-Nrf2/ARE信号通路的调控，增强了抗药性的产生。二氧化钛纳米颗粒(TiO2 NPs)是一种家蚕的饲料添加剂，能够有效提高生丝的产量，对其代谢作用机制研究显示，TiO2 NPs处理后可以缓解辛硫磷诱导的氧化应激，增强辛硫磷在脂肪体内的代谢[34]。Lu等用CncC的激活剂姜黄素喂食斜纹夜蛾幼虫，后暴露于λ-三氯氟氰菊酯杀虫剂中进行耐药性分析，发现姜黄素可诱导CYP6AB12的表达，增强杀虫剂的耐受性[35]。Zhou等也报道，原花青素可以减少ROS的产生，负调节Nrf2/ARE信号通路，保护神经元免受氯氰菊酯诱导的氧化损伤[36]。

3 展望

昆虫抗药性的不断产生，已经成为制约农业可持续发展和生态环境保护的重要因素之一，如何减缓抗药性的生成和减少农药残留是当前急切需要解决的问题。Keap1-Nrf2/ARE信号通路在引起人类氧化应激的疾病中，研究的较多和深入，但在昆虫抗药性方面的研究较少。虽然已在拟除虫菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、吡虫啉等杀虫剂方面，取得了突破性的进展，但大部分研究仍然处于初步探索阶段。昆虫体内的大部分解毒酶是否受到了Keap1-Nrf2/ARE通路的调控，或是和其它通路共同调控，内源性物质和外源性物质是否会激活该通路，诱导下游靶蛋白的表达，增强昆虫的抗药性，这些仍然是不清楚的，需要进一步研究。目前，对果蝇、赤拟谷盗、褐飞虱、马铃薯甲虫、小菜蛾、家蚕等昆虫CncC和Keap1基因，进行了基因组学和比较基因组学研究，进一步揭示了CncC和Keap1蛋白的结构和功能，以及它们之间的系统发育关系，为进一步研究昆虫抗药性分子机制奠定了基础。