屋尘样本中尘螨过敏原检测现状和发展

任雅宁，崔玉宝

1967年，Voorhorst等[1]提出尘螨是屋尘过敏原的主要来源，并且认为其在哮喘发生发展中发挥重要的作用，当尘螨在屋尘中生长时，过敏原的水平会增加。皮肤试验证明80%以上的尘螨过敏性哮喘患儿，与尘螨主要过敏原Der p 1(屋尘螨过敏原第1组分)和Der p 2(屋尘螨过敏原第2组分)密切相关[2]。根据流行病学研究结果，在床垫和地毯沉积的每克灰尘中含有2 μg的Der p 1，就被视为过敏和出现哮喘的风险因素；当每克灰尘中含有10 μg的Der p 1(即每克灰尘中含有500只螨虫)被视为过敏体质者发生急性哮喘的一个重要风险因素[3]，尘螨的数量或尘螨过敏原的浓度降低100倍以上，哮喘的症状就能得到改善。因此室内尘螨过敏原浓度是超敏反应性疾病和哮喘的风险性因素。屋尘样本在评估过敏原暴露、减少暴露水平、室内过敏原调查和过敏性疾病的临床研究中具有重要意义。本文对屋尘样本的采集和尘螨过敏原的检测进行系统综述，为制定室内尘螨控制措施提供参考依据。

1 屋尘样本中尘螨过敏原检测流程

对家庭尘样中特定过敏原的量化、分析涉及以下几个步骤：明确采样地点、屋尘采集、过敏原提取、选用合适过敏原测定方法和结果报告(图1)。首先要明确尘样采集的位置，而在这之前，需要对居住者的病史有所了解，可以通过问卷调查、录像、日记和访谈等。然后对环境进行采样，得到屋尘后从中提取尘螨过敏原。而后对过敏原进行检测。实验室过敏原分析完成后，结果可以用几种不同的方式表达，例如，每克灰尘的尘螨过敏原浓度(μg/g)，每平方米过敏原的数量(mg/m2)，以及每个采样区域的过敏原总数量(mg)[4]，大多数研究报告形式为μg/g。

图1 屋尘样本中尘螨过敏原检测流程Fig 1 Flowchart of dust mite allergens detection in house dust

2 屋尘样本采集

2.1 采样器

2.1.1 沉淀样本采集：每克屋尘样本中尘螨过敏原第1组分(group I allergen)的含量，被认为是最佳的“暴露指数”(index of exposure)表示方法[5]。屋尘样本采集的技术是在1970年以前建立起来的，并且大多数是擦拭取样技术(Wipe Sampling Methods)。McArthur[6]介绍采用擦拭取样评估表面污染，但其可靠性是有限的并且风险较高。真空吸尘器通常用于收集尘样中的过敏原，是最快捷、最简单和最实用的取样方法。

真空吸尘器采样方式主要包括滤袋式、旋风式和湿式[7]。三种方式的吸尘器均能达到同样的除尘效率，其中旋风除尘器和湿除尘器的集尘效率受到流速的影响较大，并不能断定哪种方法更优于其他方法。在使用吸尘器的过程中，其电机会释放出微小的颗粒，这些颗粒是由于与电机的旋转换向器保持电接触的碳刷磨损而产生的，从而增加了气传过敏原的含量。为解决这一问题，吸尘器厂家提供了滤袋。滤袋的层数对于尘样的收集效率也是有影响的，将其不同层数的滤袋放在相同吸尘器中进行比较，三层滤袋的收集效果最好，二层滤袋突出了制造商之间的差异，单层滤袋的表现是较差的[8]。吸尘器最初设计是用来收集大的灰尘颗粒，然后却忽视了细颗粒物，通常细颗粒可以到达肺深处并且伤害性极大，但已有一些厂家生产出了带有高效过滤器(high efficiency particulate air，HEPA)的真空吸尘器来收集存在于地毯和地板上的较细颗粒物质，Lioy等[9]测试了11台标准真空吸尘器的细颗粒收集效率和其电机对细颗粒的排放速率，其中包括普通真空吸尘器和含有HEPA的真空吸尘器，结果显示含有HEPA的真空吸尘器可以捕获大于99%的细颗粒。并且提出如果一个真空吸尘器中含有滤袋以及HEPA，其效果是最好的。

尽管接触过敏原最常见的途径是吸入，但一些携带过敏原的颗粒，尤其是尘螨，会迅速从空气中沉淀下来，因此方便且易于使用的真空采样器已经被用于许多过敏原研究。大多数方法是通过过滤将灰尘收集到真空吸尘器或泵的容器中，丹麦ALK(Allergologisk Laboratorium København) “公司”生产的吸尘器，易于使用。该设备由喷嘴组成，喷嘴连接到真空吸尘器软管上，灰尘被收集到塑料盘的滤纸上。1991年Roberts等[10]开发了高体积小表面取样器(high volume small surface sampler，HVS3)用于收集含粉尘的农药残留，并且是一种专门用于收集室内灰尘的真空取样器。HVS3被认为目前室内屋尘取样的“金标准”，它使用各种旋风收集器收集大于5 μm的粒子和一个最终HEPA过滤器收集更小的粒子，其重量轻，收集效率高，并且可以快速清理和检测残留农药，铅等，但HVS使用成本高，用于较小规模的研究中[11]。在尘螨和蟑螂暴露水平的研究中，通常采用强力螨(Eureka “Mighty Mite”，EURK)，检测时将19毫米× 90毫米的纤维素提取套管放入真空延长管的远端，并用橡胶o形圈密封[12]。ReadiVac为手持吸尘器，由Douglas-Quickut(Walnut Ridge，Arkansa)所研发，提供2.1A真空清洗电机的吸力，将空气通过喷嘴面积约为16.7平方厘米的区域，颗粒由覆盖在该采样器的风扇外壳和塑料喷嘴内部的过滤器所收集[13]。

2.1.2 其他样本采集：1992年，Tovey等[14]采用皮氏培养皿来收集空气中沉降粉尘中家庭尘螨过敏原，其最大的特点是可以应用于大规模的研究中，易于使用且价格便宜。但收集尘样的面积相对较小，采样时间较长。Noss等[15]研制出静电尘落器(electrostatic dust fall collector，EDC)，其由一个定制的聚丙烯取样器组成，具有4块静电布，每块面积为0.032平方米，有采样面积增大和采样时间缩短的特点。空气中的灰尘落到EDC表面，即可被布的静电特性捕获。但为了获得真实的个人暴露水平，新型个人吸气式粉尘采样器(institute of occupational medicine，IOM)[16]的设计就是对工作场所中所接触到的气溶胶进行采样，真正反应每个佩戴者真实的屋尘暴露情况。为了方便于患者，2003年Custis等[17]设计出离子充电装置，可插在家中的插座上，其是通过创造一个正电场来捕获粒子，粒子通过电场而黏附于极板上，随后将电极板上的粒子直接进行洗脱并检测，最终获得空气中过敏原的水平。2016年Tovey等[18]研制出24小时监测个人接触尘螨过敏原生物气溶胶的微型摄影取样器，其对尘螨过敏原的研究开辟了新领域。此外，暖气、通风和空调(heating，ventilation，and air conditioning，HVAC)过滤器有望成为高容量且长期的采样器，其特点在于收集的灰尘标本可用于分析尘样中的微生物群[19]。

虽然采样方法很多，但仍然缺乏一种标准化方法，在选择采样方式时，需要考虑多种因素，其中主要包括精确度、准确度，以及收集的过敏原数量是否与致敏性相关等，其次还需要考虑检测成本、技术人员和受试者的负担，仪器的便携性和可操作性等。Grant等[20]对不同类型采样器的优缺点进行评价，表明每种检测仪器或方法都有其局限性和不足，因此可以根据自己的研究目的来选择不同的方法，以便进行后续研究(表1)。

表1 常见采样器举例及其特点Table 1 Common dust sample collecters and their characteristics

2.2 尘样中过敏原提取和尘螨分离

为了获得待测过敏原，我们需要从尘样中提取过敏原。有试验比较4种不同的缓冲液(包括添加或不添加0.05% Tween 20的硼酸盐缓冲液(BBS)和添加或不添加0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBS))对样本分别进行提取并且计算其对应的所提取过敏原浓度，结果显示推荐使用0.05% Tween 20的PBS[21]。从尘样中分离活螨和死螨，目前最常用的方法是漂浮和悬浮[22]。

2.3 取样器评估

对不同采样器进行比较时通常从尘样收集重量即收集效率(collection efficiency，CE)、气传过敏原含量、从尘样中获取过敏原浓度(concentration ratio，CR)这三方面进行比较。CE通常用于评估采样器性能，CE随采样器和粒度分数的不同而变化很大。气传过敏原含量则反应了采集器出现过敏原渗漏现象。除此之外，还应考虑采样器重量、坚固性、操作方便性和过滤原件的数量等参数。

3 影响尘样收集因素

3.1 湿度和温度

尘螨的生存依靠于温度，环境相对湿度(relative humidity，RH)。Arlian等[23]已证明湿度是调节尘螨取食和水分平衡的重要因素。对于螨虫来说，唯一的水源是从周围空气的水蒸气中所获得的。平均日相对湿度维持在50%以下可以有效抑制螨类种群的生长[24]。当暴露于-18℃、48小时以上时，大多数的尘螨无法存活[25]。在不同的季节中，温度和湿度是不同且变化的，因此尘螨种群密度的消长与气候条件变化有关。Der p 1浓度从秋季中旬到冬季是最高的，在夏季中旬是最低点。螨虫流行率与室内的季节性波动是有关系的，在夏季末，随着湿度和温度的增加，尘螨种群会增加，使得变应原浓度达到高峰[26]。

3.2 采样地点

采样地点十分重要，即对室内哪些物体表面进行吸尘，从而获得足够数量的样本，反映出可能的最高暴露水平。室内地毯、床垫、沙发和窗帘上的灰尘中发现了高水平的过敏原。因此，检测室内装饰、床垫、地板表面积尘是评估过敏原暴露最常用的地点[27]。通常，基于单个家庭采样的单一或者少数的灰尘样本的流行病学研究不能恰当地表示家庭尘螨呈阴性，这时就需要对多个地点进行采样。

4 室内尘螨过敏原检测方法

室内尘螨过敏原的检测方法在不断的发展(图2)，Voohorst等(1967)[1]在显微镜下发现了屋尘螨，镜检可以观察尘螨形态并对其进行计数(包括死螨和活螨)和分类[28]。但鉴定螨种需要很强的专业性，并且需要时间较长，无法适用于大量样品。随后Tovey等[29]利用放射过敏原吸附试验(radioallergosorbent，RAST)和放射免疫法(radioimmunoassay，RIA) 对屋尘中的过敏原进行检测。后来发现许多地方同时存在Der p 1和Der f 1，而同时又证明两者间具有共同的抗原表位，所以通过免疫渗滤(immunodiffusion)发现主要针对Der p 1和Der f 1上存在的共同抗原决定因素(称为Ag P1 Eq)，采用双位点RIA进行检测，根据每克粉尘中的Ag P1 Eq来评价螨过敏原的含量水平[30]，该方法表明Ag P1 Eq可以准确地反应屋尘或尘螨提取物中存在的尘螨过敏原的含量。1985年10月1日起ACAREX试验(ACAREX-Test)开始进行商业销售[31]。其原理是将鸟嘌呤固定在一种带有红色的偶氮染料上来测量鸟嘌呤的含量，通过观察颜色来对其进行分析。鸟嘌呤是蛛形纲动物的主要分泌物，是尘螨粪便和Der p 1过敏原浓度的标志物，灰尘中的鸟嘌呤浓度与尘螨Der p 1过敏原浓度及尘螨种群密度之间具有明显的统计学相关性。ELISA是目前尘螨过敏原浓度定量测定最广泛的方法[32]，一般使用商用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(indoor Biotechnologies，Clwyd，UK)，其中双位点单克隆抗体(Mab)ELISA可同时检测主要吸入性过敏原Der p 1和Der f 1，采用了一种非同位素免疫分析法使单克隆抗体在Der p 1和Der f 1上识别一个共同的表位[33]。点印迹法(dot blot)可以半定量的估计过敏原含量，快速简单，巧妙地利用的尘螨引起过敏反应的临界值：床垫和地毯中沉积的每克灰尘中含有2 μg的Der p 1，就被视为过敏和出现哮喘的风险因素[34]。在大型流行病学研究或以人群为基础的环境调查中，由于样本量较大，2007年Earle等[35]采用荧光多重阵列实现了同时检测室内6 种包括屋尘螨、粉尘螨、猫过敏原和犬过敏原(Der p 1：The group 1 allergen fromDermatophagoidespteonyssinus、Der f 1：The group 1 allergen fromDermatophagoidesfarinae、Der p 2：The group 2 allergen fromDermatophagoidespteronyssinus、Der f 2：The group 2 allergen fromDermatophagoidesfarinae、Fel d 1：The group 1 allergen fromFelisdomesticus和Can f 1：The group 1 allergen fromCanisfamiliaris)过敏原水平，方法是采用纯化的天然过敏原组成的通用标准，利用单抗与荧光微球共价偶联(luminex xMAP system)，建立了6种过敏原的多重阵列。2013年Roussel等[36]利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测环境中的尘螨过敏原含量，利用引物及探针分析尘螨过敏原的核酸含量，实现定量检测。2017年Spiric等[37]提出多反应检测(MRM)质谱法不仅可以实现对过敏原的定量检测而且可以测定尘螨过敏原的物种及序列特异性，并且灵敏度较高。每种检测方法都有其特点(表2)，应选择适当方法做出准确检测。就目前而言，用于实验室的过敏原检测方法在不断的发展，而方便于普通大众用于家庭过敏原的检测方法还是缺少。因此期待这些检测可以对过敏患者的家庭灰尘过敏原管理提供有用的帮助。

图2 建立尘螨过敏原检测方法的时间轴Fig 2 Development of dust mite allergen detection method

表2 屋尘样本中尘螨过敏原常见检测方法Table 2 Common detection methods of dust mite allergens in house dust

5 问题与展望

随着技术的进步，人们对屋尘采集和过敏原检测技术在不断提高，但仍然存在一些问题。其一，缺乏便于患者的家庭检测方法，使患者对家庭暴露水平了解较少。同时在检测方面，要加强定量检测，从而对患者达到更精准的治疗。其二，缺乏标准化的尘样采集方法，不同的采样器都有其优缺点也很难进行比较。其三，以家庭为基础的干预是有效的，但仍然缺乏对其知识的教育，为此不应该仅仅聚焦于患者，更要放眼于普通群众，增加教育，如通过科普书籍、网络、自媒体等手段增加尘螨基础知识及其危害的宣传教育。