乳腺浸润性导管癌超声灰度直方图特征与HER-2 表达的相关性

徐茂林，李芳，曾书娥*，翁高龙

1.吉林大学中日联谊医院放射线科，吉林 长春 130033；2.湖北省肿瘤医院超声科，湖北 武汉 430079；*通信作者 曾书娥 zengshue7799@sina.com

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）作为乳腺癌肿瘤标志物之一，其过度表达常提示预后不良及肿瘤复发率较高，并与临床内分泌治疗耐药性及靶向药物赫赛汀治疗敏感度有关[1-8]。目前文献报道乳腺癌的二维超声、超声弹性成像及超声造影等表现与HER-2的表达具有一定的关联性[1,6,9-10]。直方图分析法可用于描述图像中像素的灰度分布情况，反映肿瘤内部的差异性和不均质性[11-12]。目前国内外有关乳腺癌超声图像灰度直方图特征与HER-2表达相关性研究尚少。浸润性导管癌（infiltrating ductal carcinoma，IDC）是乳腺癌中最常见的病理类型，本研究通过分析IDC的超声图像的灰度直方图特征参数，与HER-2的表达作关联性分析，以期为超声预测HER-2表达提供更多参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析湖北省肿瘤医院2018年9月—2020年12月的乳腺IDC患者175例（175个病灶），均为女性，年龄31～85（51.77±9.88）岁。纳入标准：单发单侧肿块型病灶，超声检查前未行穿刺活检、放化疗等治疗；术前超声图像、术后病理及免疫组织化学资料完整。排除标准：多发或非肿块型乳腺病灶；超声检查前有穿刺活检或相关治疗病史；病灶超声图像质量差或病理学相关诊断有争议。本研究经湖北省肿瘤医院伦理委员会审批同意（批准号：LLHBCH2021YN-001）。

1.2 仪器与方法 采用Philips EPIQ5彩色多普勒超声诊断仪，配置L12-5型线阵探头，探头频率为5.0～12 MHz。让患者仰卧位，外展上臂同时充分暴露双侧乳腺，固定超声仪器时间补偿增益，增益调定在固定水平，对所触及的乳腺病变区进行多切面探测，必要时进行双侧对比。

1.3 图像分析 应用MaZda软件（4.6版，http：//www.eletel.p.lodz.pl/mazda/）进行纹理分析[11]。图像通过影像归档和通信系统（PACS）下载并导入软件中进行分析。由2名超声诊断经验丰富的高年资医师（1名主任医师和1名副主任医师）采用双盲法分别评阅，判断不一致者经讨论达成统一，感兴趣区（ROI）选择病灶最大径层面，沿病灶边缘轮廓勾画，在纹理特征生成之前先进行图像灰度的标准化[（μ-3δ，μ+3δ）范围内标准化其灰阶水平]，生成的直方图参数包括均值，方差，偏度，峰度及第1、10、50、90、99百分位数。最后以2名医师测量值的平均值与HER-2的表达作相关性分析。

1.4 病理及免疫组织化学指标分析 对所有手术切除的标本进行常规取材、固定、染色，使用光学显微镜观察。组织学分级采用Elston和Ellis改良的Bloom-Richardson半定量分级法[13]，由两名病理诊断经验丰富的高年资医师于光镜下以双盲法行病理诊断，根据腺管形成、核多形性异型性、核分裂像计数3项指标进行分级，包括I级、Ⅱ级、Ⅲ级，诊断意见有分歧时经协商达成一致；腋窝淋巴结转移以术后淋巴结石蜡标本阳性为标准。HER-2结果为0或1＋者归为HER-2阴性组，2＋同时基因扩增阴性者亦归为阴性组，3＋、2＋同时荧光原位杂交（FISH）基因扩增检测为阳性者均归为阳性组[1,7,12,14]。

1.5 统计学分析 应用SPSS 26.0和MedCalc 12.7.2软件分析数据。应用组内相关系数（ICC）对2名医师测量结果的一致性进行评估。对于计量资料数据，符合正态分布用表示，组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布者以M（Q1，Q3）表示，并作Mann-WhitneyU检验；计数资料以例数表示，应用χ2检验进行比较。应用Spearman秩相关分析直方图参数与HER-2阳性表达的相关性。对具有统计学意义的直方图参数，作受试者工作特征（ROC）曲线分析并计算曲线下面积（AUC），同时应用Delong检验比较不同参数AUC值的大小。通过最大约登指数（敏感性＋特异性-1）计算得出最佳诊断截断值。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床及病理特征结果 本研究所有病例均为乳腺非特殊类型IDC。HER-2阳性组和阴性组患者年龄及月经状态差异均无统计学意义（均P＞0.05）。HER-2阳性组肿瘤组织学分级中Ⅲ级所占比例、腋窝淋巴结转移率高于HER-2阴性组（均P＜0.05），肿块的最大径与HER-2阴性组比较，差异无统计学意义（P=0.053），见表1。

2.2 超声灰度直方图参数测量的一致性 两名医师测量均值、方差、偏度、峰度及第1、10、50、90、99百分位数具有很好的可重复性（ICC=0.870～0.999）。

2.3 超声灰度直方图参数与HER-2阳性表达的相关性及其预测HER-2表达的诊断效能 方差、第90、99百分位数与HER-2阳性表达呈正相关（r=0.422、0.259、0.361，P＜0.001、P=0.001、P＜0.001）；而病灶均值、偏度、峰度及第1、10、50百分位数与HER-2表达均无明显相关性（r=0.141、-0.015、-0.048、-0.104、0.009、0.111，P均＞0.05）。HER-2阳性组和HER-2阴性组的直方图参数的差异见表2，HER-2阳性组的方差、第90、99百分位数显著高于HER-2阴性组（P均＜0.05）（图1、2）；而两组间的均值、偏度、峰度值、第1、10及50百分位数差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

图1 女，54岁，左乳浸润性导管癌。A.左乳形态欠规则的低回声光团，内部回声欠均匀；B.病灶的ROI选择；C.灰度直方图，均值、方差、偏度、峰度值以及第1、10、50、90及99百分位数值分别为40.891、538.58、0.769 37、0.933 23、1、13、38、72、109；D.HE染色（×200）示：左乳浸润性导管癌；E.免疫组化染色（×200）示：HER-2（0）

图2 女，50岁，右乳浸润性导管癌。A.右乳低回声病灶，形态不规则，其内可见强光斑回声；B.病灶的ROI选择；C.灰度直方图，均值、方差、偏度、峰度值以及第1、10、50、90及99百分位数值分别为117.64、754.11、0.411 17、0.655 26、58、85、116、153、194；D.HE染色（×200）示：右乳浸润性导管癌；E.免疫组化染色（×200）示：HER-2（3+）

表2 HER-2阳性组和阴性组的超声灰度直方图参数比较

方差、第90及99百分位数预测HER-2阳性表达的诊断效能见表3、图3。其中，方差预测HER-2表达的AUC大于第90百分位数（Z=2.924，P=0.004）；第99百分位数预测HER-2表达的AUC大于第90百分位数（Z=3.078，P=0.002）；方差预测HER-2表达的AUC大于第99百分位数，但两者差异无统计学意义（Z=1.428，P=0.153）。

图3 方差、第90及99百分位数诊断HER-2阳性表达的ROC曲线

表3 方差、第90及99百分位数预测HER-2阳性表达的诊断效能

3 讨论

3.1 超声灰度直方图特征与HER-2表达关联性研究的必要性 目前已有研究报道了常规超声、弹性成像及超声造影表现特征与HER-2表达的相关性[1,9-10,15]。然而，常规超声的表现特征相对较少，且不同超声医师对特征的判读可能会受到主观性因素的影响。影像组学的临床研究范围越来越广泛，基于图像提取高通量的组学特征能客观、定量地反映肿瘤的基因异质性[11,14]。影像组学的一阶统计特征是基于直方图分析法描述图像中像素的灰度分布情况，超声灰度直方图能较好地反映肿瘤的异质性[11]。鉴于此，本研究通过对IDC的常规灰阶超声图像进行直方图分析，探讨其与HER-2表达的关联性。

3.2HER-2的临床意义HER-2是目前研究越来越深入的乳腺癌分子标志物，其表达与乳腺癌的发生、增殖和转移密切相关，HER-2过度表达通常提示预后不良，复发和转移率高[10,15]，已成为预测乳腺癌发生、发展的独立指标[9,16]。应用分子靶向药物是HER-2阳性表达的乳腺癌患者的重要治疗方案，可显著提高肿瘤治疗效果，HER-2的表达情况是决定患者术后进行个体化治疗的重要参考依据[2,10,17]。临床上乳腺癌患者中约有20%～30%存在HER-2基因扩增和过度表达[1,8,18]，而本研究HER-2阳性组在所有IDC中所占比例约为37.71%（66/175），稍高于先前文献报道数据，可能与本研究纳入患者病理组织学类型均为IDC有关。本研究证实HER-2阳性组中组织学分级III级者及腋窝淋巴结转移率均多于HER-2阴性组（P均＜0.05），与前人报道相符[10,19-21]，这可能与HER-2阳性组的瘤灶组织中癌细胞侵袭力强以及HER-2蛋白在细胞表面累及过多增加了癌细胞信号的传导等因素有关[19]。本研究发现HER-2阳性组和阴性组患者的年龄无明显统计学差异，与祁川川[19]、刘岩岩等[22]研究结果相同。既往研究[1,15]认为HER-2阳性表达时癌细胞增殖能力强，肿瘤细胞生长旺盛，故HER-2阳性组病灶最大径大于HER-2阴性组。然而本研究尚未发现病灶最大径在两组间具有统计学差异，与何美情等[10]研究一致，原因可能是HER-2阳性表达与病灶最大径的相关性还不够强，故容易受到其他临床病理或影像学因素的干扰而导致二者关联性不显著。

3.3 IDC癌灶的超声灰度直方图特征与HER-2表达的相关性分析 直方图分布的对称性可用偏度描述，峰度是用来描述分布产生离群值可能性大小的指标，而方差表示平均值的变化情况[11]。本研究尚未发现均值、偏度、峰度与HER-2表达的相关性，但方差与HER-2的阳性表达呈正相关，同时ROC曲线显示方差诊断HER-2阳性表达的AUC最大且敏感度最高，表明HER-2阳性组的肿瘤异质性较HER-2阴性组更高。笔者分析其病理学基础为：HER-2阳性表达常引起过度增生的蛋白产物，导致细胞外型的异型增生[23]；另外HER-2的阳性表达亦可促进肿瘤的快速生长，肿瘤内部营养供应不足可造成局部缺氧坏死[24]。第n百分位数的差异在一定程度上代表了不同肿瘤间病灶内部构成或分布的不同[14]。本研究发现第1、10及50百分位数与HER-2的表达无明显相关性，而第90及99百分位数与HER-2的阳性表达呈正相关，同时ROC曲线显示第99百分位数预测HER-2阳性表达的特异度最高。结合文献[1,24]考虑可能的原因为：HER-2阳性表达时肿瘤生长过快，肿瘤细胞耗氧增加导致营养供应不足，细胞发生变性溶解，引起钙盐沉积形成微钙化，而钙化可引起局部超声灰度值更高，因此较高的百分位数值与HER-2阳性表达呈正相关。

3.4 研究的局限性 ①本研究为回顾性研究，所有病例的组织学类型均为IDC，且剔除了超声图像质量差、影响数据分析的病例（比如合并斑点噪声、低对比度的图像），可能会造成一定的选择偏倚。②ROI选取病灶的最大层面而不是整个病灶，可能会对造成一定的采样误差。③没有对灰度共生矩阵、游程矩阵、梯度模型、自回归模型等纹理特征进行分析；未分析本组乳腺病灶的常规超声、弹性成像及超声造影特征。④除了分析观察者间的一致性，本研究未讨论其他可能因素对直方图参数的影响，有待后续深入探讨。

总之，IDC癌灶具有较高的异质性，传统的超声图像主要依赖超声医师肉眼观察，具有一定的主观性，且缺乏定量数据资料，超声图像灰度直方图分析法能对乳腺病变进行多参数定量评估，获取更多的影像学信息，且具有很好的可重复性，与IDC癌灶HER-2的表达具有一定的相关性，其中方差、第90、99百分位数可为预测HER-2的表达提供一定的参考价值。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突