狼毒大戟愈伤组织粗多糖的闪式提取工艺优化研究

徐亚男， 刘懿萱， 刘亮亮， 王 淼， 姜 军， 朴炫春

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

狼毒大戟(EuphorbiafischerianaSteud)是大戟科大戟属多年生草本植物，主要分布于东北、河北等地区，国外苏联西伯利亚地区也有分布。全株均有毒性，根毒性最大[1]。全草含刺激性乳汁，皮肤接触后，能引起水泡。其含有多种药用成分，包括萜类[2]、多糖[3]等。多用作治疗淋巴结结核，骨结核，皮肤结核等疾病，具有极高的药用价值。然而，狼毒大戟的野生资源逐年减少，加之尚未建立人工栽培体系，使植物材料较为缺乏，导致其深入研究和产品开发及生产受到限制。植物细胞或器官培养为一种可替代植物资源传统生产的方法之一，可在短期内获得大量植物材料。该实验室在前期研究中，已经从狼毒大戟叶片中成功诱导出狼毒大戟愈伤组织，且发现狼毒大戟愈伤组织中含有较多的多糖，表明其存在潜在的应用价值。

植物多糖是植物体内的一种活性成分，随着研究的深入，植物多糖逐渐被人们重视，在近年研究中，植物多糖被证实有降血脂[4-5]、抗氧化[6-7]、抗炎[8-9]等作用。目前，多糖的提取方法主要有超声提取法[10-11]、酸碱提法[12-13]、生物酶提法[14-15]等，与上述方法相比，闪式提取法具有用时短、效率高等优点[16-17]。闪式提取是一种应用于植物组织破碎的新式提取方法，主要由控制系统、电动机、刀盘、提取罐和底座组成，利用高速机械剪刀和超动分子渗透技术对植物的根、茎、叶进行提取，将组织磨碎至超微颗粒，使各种成分达到细胞内外平衡，从而达到提取的目的，其用时短，通常30 s能够完成，对植物成分破坏小，且除挥发性溶剂，如乙醚外，其他溶剂均可使用[18]。目前，许多植物已经建立了闪式提取的提取工艺，如隋志方等[19]进行了代代花的闪式提取，优化的条件为液料比21∶1 (mL∶g)，提取电压145 V，提取时间100 s，此条件下的黄酮得率为10.81%；叶润等[20]以油茶叶为试验材料，研究提取时间、液料比和提取温度对多糖得率的影响，筛选出的闪式提取条件为液料比30∶1 (mL∶g)，提取温度81 ℃，提取时间75 s，此条件下，油茶叶多糖得率为8.43%；冯素香等[21]以连翘为试验材料，研究乙醇浓度、液料比、提取时间对提取物中连翘苷含量的影响，从而筛选出最佳提取工艺为电压120 V，液料比10∶1 (mL∶g)，提取1 min，提取2次，此条件下连翘苷的含量为4.50 mg/g。

提取工艺的优化常常与响应面法结合。响应面法是一种建模方法，最早是由数学家Box和Wilson于1951年提出来的[22]，是通过一系列确定性的“试验”拟合一个响应面来模拟真实极限状态曲面，其基本思想是假设一个包括一些未知参量的极限状态函数与基本变量之间的解析表达式代替实际的不能明确表达的结构极限状态函数。它允许优化指定变量，例如在植物材料提取中，可以同时估计几个不同的自变量来获得具有最高水平的提取物。响应面方法已应用于辣木叶[23]、赤瓟子[24]、唐古特白刺果实[25]、暴马丁香[26]和紫薯[27]等植物的提取工艺优化中。

该研究为了将狼毒大戟愈伤组织多糖应用于实际生产中，利用闪式提取法，采用响应面设计对闪式提取的液料比、提取时间以及提取温度条件进行了优化，并测定优化后的狼毒大戟愈伤组织多糖的DPPH自由基清除能力，这对今后狼毒大戟愈伤组织多糖的工业化提取具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

将野生狼毒大戟茎叶经无菌消毒后诱导出愈伤组织，将10 g/L新鲜的愈伤组织接种于5 L反应器内(含有4 L的培养液)，培养液配比为MS+1.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，pH值调节为5.8，通气量为0.1 vvm，25 ℃条件下光培养21 d后，进行收获，收获的细胞用自来水清洗后，置于45 ℃恒温干燥箱中烘干48 h，即得狼毒大戟愈伤组织干品。将上述干品研磨，过80目筛，粉末密封保存，备用。

1.2 仪器与药品

JA2002电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；JHBE-50T闪式提取仪(上海钒帜精密设备有限公司)；YHW-1103远红外鼓风干燥箱(中国天津市华北实验仪器有限公司)；UV1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；所用试剂苯酚、硫酸、无水甲醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine, DPPH)、维生素C(Vitamin C, VC)、葡萄糖购于上海源叶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖提取的单因素试验

1) 液料比的筛选

称取狼毒大戟愈伤组织粉末5.00 g，置于250 mL三角瓶中，固定提取时间40 s，利用闪式提取仪进行提取，液料比分别为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 (mL∶g)(溶剂为蒸馏水)，所得液体滤纸过滤，烘干箱烘干，测定提取物中总多糖含量，筛选出最适液料比。

2) 提取时间的筛选

称取狼毒大戟愈伤组织粉末5.00 g，置于250 mL三角瓶中，固定液料比40∶1 (mL∶g)，利用闪式提取仪进行提取，提取时间为30、40、50、60和70 s，所得液体滤纸过滤，烘干箱烘干，测定总多糖含量，筛选出最适提取时间。

3) 提取温度的筛选

称取狼毒大戟愈伤组织粉末5.00 g，置于250 mL三角瓶中，固定液料比40∶1 (mL∶g)、提取时间50 s，利用闪式提取仪进行提取，提取温度分别为30，40，50，60和70 ℃，所得液体滤纸过滤，烘干箱烘干，测定总多糖含量，筛选出最适提取温度。

1.3.2 响应面试验

在单因素试验的基础上，以液料比(X1)，提取时间(X2)，提取温度(X3)3个因素为自变量，依据Box-Behnken法进行3因素3水平试验设计(表1)，共计17个组合。按照各组合条件进行闪式提取，以提取物中总多糖含量为响应值。最后，对优化组合进行3次重复的验证试验，确定最佳提取工艺。

表1 响应面试验因素及水平

1.4 总多糖含量测定

参照Ye等[28]测定多糖的含量。制作多糖标准曲线，精密称取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容至100 mL容量瓶中，即浓度为1.0 mg/mL的葡萄糖溶液。将该溶液稀释为0.010、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125和0.150 mg/mL。分别取1 mL于试管中，加入1 mL 5%苯酚，再加入5 mL浓硫酸，室温放置30 min，空白对照为蒸馏水。利用紫外分光光度计在490 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。

称取狼毒大戟愈伤组织提取物干品100 mg，加蒸馏水定容至100 mL，即得1.0 mg/mL的待测样品溶液。取0.5 mL于试管中，加入0.5 mL蒸馏水，1 mL 5%苯酚，再加入5 mL浓硫酸，室温放置30 min，此时溶液变为橙黄色，呈微稠状。在490 nm处测定吸光值，计算多糖的含量。

总多糖含量/(mg·g-1)=(CDf)/W，

式中,C为样品溶液的葡萄糖浓度(mg/mL)；D为稀释倍数；f为换算因子；W为样品重量(g)。

1.5 清除DPPH自由基活性测定

参考陈琦[29]对DPPH自由基清除能力进行测定，并稍加改动。称取40 mg利用响应面最优条件提取的粗多糖提取物(CE)置于离心管，用甲醇定容至10 mL，使样品最终浓度为4.0 mg/mL，将准备好的上述溶液用二倍稀释法稀释至浓度为0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL的待测定样溶液样品，VC为阳性对照，配置方法同样品配置方法。称取DPPH粉末0.003 9 g，用甲醇定容至100 mL。将2 mL待测样品溶液与2 mL的DPPH溶液混合，作为待测样品组。用2 mL甲醇代替待测样品，作为空白对照。避光静置30 min后，溶液呈淡紫色，用紫外分光光度计在517 nm下测定吸光值，DPPH自由基清除率计算如下。

清除率=(A空-A样)/A空×100%，

式中，A空为空白对照组吸光值，A样为待测样品组吸光值。

1.6 统计分析

试验进行3次重复，数值为平均值±标准偏差。使用SPSS 22.0对数据进行单因素试验中显著性差异分析、GraphPad Prism 8.0软件绘制单因素试验及DPPH自由基清除试验图，使用Design Expert 10.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对提取物中总多糖含量的影响

由图1可知，总多糖含量随着液料比的升高而升高，当液料比为40∶1 (mL∶g)时，总多糖含量最高，液料比继续升高，总多糖含量并没有继续上升，可能是溶剂少使闪式提取仪搅拌器的阻力过大，影响转速。液料比高，溶剂过多，闪式提取仪搅拌器刀片不能充分与物质接触，不利于多糖的提取。

2.1.2 提取时间对提取物中总多糖含量的影响

由图2可知，在狼毒大戟愈伤组织多糖提取过程中，随着提取时间的增加，总多糖含量逐渐上升，在提取时间为50 s时，提取物总多糖含量最高，达到373.20 mg/g，随着提取时间的增加，总多糖含量并没有继续上升，无显著性差异。因此，50 s为最适合狼毒大戟愈伤组织粗多糖提取的时间。

注：数值为平均值 标准偏差(n=3)。不同字母表示0.05水平上差异显著，下同。

图2 提取时间对总多糖含量的影响

2.1.3 提取温度对提取物中总多糖含量的影响

由图3可知，随着提取温度的升高，总多糖含量逐渐上升，在50 ℃时，总多糖含量达到最高。温度是影响多糖溶解速度的重要因素，温度低，物质流动速度慢，温度高破坏多糖结构。因此，由试验结果可知，50 ℃是最有利于狼毒大戟愈伤组织粗多糖提取的温度。

2.2 响应面法优化提取工艺

在上述单因素试验的基础上，利用响应面分析法的Box-Behnken Design方法，进行了3因素3水平的试验设计。结果表明，不同试验组提取物中的总多糖含量有很大差异(表2)。以各试验组总多糖含量作为响应值建立了响应面设计模型，经多元拟合回归分析，得到二次回归模型方程：

Y=420.97-0.97X1+4.62X2+6.04X3+0.56X1X2+1.87X1X3-17.16X2X3-62.26X12-42.34X22-14.14X32，

式中，X1、X2、X3分别代表液料比、提取时间、提取温度，Y为总多糖含量预测值。

图3 提取温度对总多糖含量的影响

表2 响应面试验设计与结果

F值从大到小的顺序为提取温度(F=6.15)，液料比(F=3.60)，提取时间(F=0.11)，说明对总多糖含量影响最大的是提取温度，其次是液料比，提取时间的影响最小(表3)。

表3 方差分析结果

响应面分析法中，用试验数据绘制多元二次回归方程，进而预测最优工艺参数。该研究对狼毒大戟愈伤组织粗多糖闪式提取的3因素3水平进行了响应面分析，结果表明，回归模型充分拟合试验数据，因此，用此模型分析结果可用于提取工艺的优化。

回归模型给出的最佳提取工艺参数为液料比39.967∶1 (mL∶g)，提取时间50.128 s，提取温度52.034 ℃。该研究通过3次独立试验对此工艺进行了验证。从表4可以看出，3次重复试验的总多糖含量为423.26、418.69和419.67 mg/g，相对标准偏差(RSD)为0.57%，表明3次重复试验结果稳定，且与预测值吻合。因此，该研究中响应面分析所预测的最优组合可用于实际提取工艺中。

表4 验证试验结果

2.3 清除DPPH自由基能力

按照上述提取工艺优化后的条件对狼毒大戟愈伤组织进行提取。如图4所示，随着提取物浓度上升，DPPH自由基清除率逐渐上升，当提取物浓度上升至2 mg/mL时，清除率达到95%，浓度继续上升，清除率保持稳定。

图4 提取物清除DPPH自由基能力

3 讨论与结论

到目前为止，已经开发了许多技术来提取植物中的化合物，包括热回流提取、索氏提取等传统技术和超声辅助提取、脉冲电场提取等新兴技术，与新兴技术相比，传统技术耗时、耗能和溶剂消耗高[30]。新兴技术也存在不可忽视的问题，由于技术和理论研究不够充分，仪器复杂和操作成本相对较高，这些技术的工业应用仍处于萌芽阶段。闪式提取可以有效解决上述问题，不仅能够在极短的时间内实现高产，操作简单，设备便宜，而且具有较高的工业实践性。到目前为止，闪式提取已被应用于提取植物中含有的初级代谢物和次级代谢物[31]，贺石麟等[32]以淫羊藿苷和总黄酮含量为指标，通过正交试验得出闪式提取法提取其淫羊藿苷和总黄酮的最优条件。结果表明，最佳提取工艺为液料比25∶1(mL∶g)，提取3次，提取时间10 min；陈克家等[33]利用闪式提取仪提取竹叶，结果表明，竹叶多糖闪式提取的最佳工艺条件为提取时间170 s，提取电压180 V，在此条件下进行提取，所得到竹叶多糖的提取量为34.02 mg/g；杨云等[34]利用闪式提取仪天麻总酚，闪式提取最佳条件为提取时间2 min，液料比40∶ 1(mL∶g)，乙醇体积分数20%，在最佳提取条件下得到的天麻总酚含量为35.25 mg·GAE g-1。与上述试验结果相比，该试验处理时间较短，料液比则与上述结果相似，可能是试验材料不同，所以提取时间差异较大。

该试验采用响应曲面法优化了狼毒大戟愈伤组织粗多糖的提取工艺，通过单因素试验，液料比、提取时间、提取温度各因素在单一因素变化的情况下的最优值。在单因素试验结果基础上，用响应面法对提取工艺参数进行优化，建立液料比、提取时间、提取温度和多糖含量的二次回归方程模型。经验证，该数学模型可靠，可用于狼毒大戟愈伤组织粗多糖的提取优化工艺参数的预测。结合单因素试验、响应面试验和验证试验确定狼毒大戟愈伤组织粗多糖闪式提取的提取工艺参数为：液料比39.967∶1(mL∶g)，提取时间50.128 s，提取水温52.034 ℃，在此条件下，狼毒大戟愈伤组织中提取物总多糖含量为420.54 mg/g，当提取物浓度为2 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到95%。该试验为狼毒大戟愈伤组织的进一步应用提供理论依据。