4 株致病性大肠杆菌致犊牛腹泻的分离鉴定及毒力与耐药性分析

张 欢，胡朝辉，勾耀鹏，王 亮，齐亚银＊

1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003

2 新疆天润乳业股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830000

3 新疆泰昆集团有限责任公司，新疆昌吉 831100

0 引言

犊牛是牧场的未来，承载整个牧场的发展，对牧场盈利能力有着深远的影响。犊牛腹泻是影响新生犊牛健康的主要疾病之一[1]。犊牛腹泻严重影响其平均日增重和首个泌乳期矫正产奶量，经过抗生素治疗的腹泻犊牛的首个泌乳期产奶量损失可达到493 kg，还会导致受胎率降低，产犊率降低等[2]。造成犊牛腹泻的主要因素有以下方面：一是细菌因素，主要是由产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌引发。二是病毒因素，主要由轮状病毒、冠状病毒、BVD病毒引起。三是寄生虫因素，主要由以隐孢子虫和贾第鞭毛虫引起[3]。四是饲养管理因素，包括饲喂不当及外界环境冷热刺激应激等[3]。其中，大肠杆菌是引起新生犊牛腹泻的主要细菌性病原菌，普遍存在于牧场的环境里，且由于治疗中大剂量使用抗生素导致耐药菌增加，对抗生素抵抗力显著增强，治疗难度加大。犊牛大肠杆菌病主要表现为肠炎或败血症等症状。1～20日龄犊牛如患病不及时治疗易死亡[4]。本文为确定导致新疆奎屯地区某牧场犊牛出现腹泻症状的病原，对濒死新生犊牛病变脏器致病菌进行分离鉴定和一般生物学特性的研究，为该牧场犊牛腹泻的防控和治疗提供参考。

1 主要试剂与仪器

LB肉汤培养基、伊红美兰琼脂培养基、革兰氏染液、细菌生化鉴定微量发酵管，海博生物技术有限公司；药敏纸片，杭州滨河微生物试剂有限公司；引物，上海生工生物工程股份有限公司；光学显微镜，奥林巴斯公司；全自动振荡培养箱、隔水式恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；高压灭菌器，日本Hirayama公司；PCR仪、恒温培养箱，赛默飞公司。

2 方法

2.1 样品来源

2022年3月无菌采集北疆地区某牧场2 份病死犊牛肠系膜淋巴结。解剖后快速放入装有冰袋的采样箱，备用。

2.2 分离鉴定

将样品在超净工作台中取出，使用长柄镊子夹取酒精棉球点燃灼烧样品表面，以达到杀灭表面细菌的作用，避免环境中细菌污染；使用高压灭菌后的剪刀剪开样品，取绿豆大小脏器组织置于装有含有5 mL LB肉汤培养基的试管中。编号后放于摇床中增菌12 h，次日取出少量浑浊菌液于载玻片上涂开，革兰氏染色后，观察镜检结果；用接菌环取少量浑浊菌液在伊红美兰固体培养基中进行四区划线，恒温培养箱培养12 h后观察，次日挑取黑红色具有金属光泽的单个菌落，置于装有5 mL LB肉汤培养基的试管中增菌培养12 h，得到纯化后的菌液。

2.3 生化鉴定

按照生化鉴定试剂/鉴定管说明书进行操作。

2.4 PCR 鉴定

本试验以纯化后的菌液作为PCR反应体系中的模板。细菌16 sRNA通用引物序列大小为1540 bp，见表1。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳试验。

表1 细菌16sRNA通用引物序列

2.5 大肠杆菌分离株常规毒力基因检测

本试验以细菌16sRNA引物鉴定后的分离株为模板，参照大肠杆菌毒力基因引物（表2）[5]反应程序和体系进行PCR检测，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳试验 。

表2 大肠杆菌毒力基因

2.6 药物敏感性试验

选取9 种牧场常用的药物，在超净工作台内吸取200 μL培养后的纯菌液，分散滴在脑心浸出液琼脂平板上，然后使用灭菌过的涂布棒顺时针涂匀直至培养基表面光滑，最后将药敏纸片贴在培养基上并在相应的位置进行标记，37 ℃恒温培养箱中培养12 h，量取各个药敏纸片抑菌环的直径。根据NCCLS（美国临床试验室标准化委员会）标准判定试验结果。

3 结果与分析

3.1 大肠杆菌鉴定结果

肠系膜淋巴结在LB肉汤培养基过夜培养后镜检可观察到大量两端钝圆革兰氏阴性短杆菌（图1），在伊红美兰培养基培养后可观察到金属光泽菌落（图2）。

图1 肠系膜淋巴结培养后镜检图片

图2 伊红美兰琼脂培养基

3.2 生化鉴定结果

按照生化鉴定说明书操作得到1 株大肠杆菌致病分离株，生化鉴定结果见表3。

表3 分离菌肠杆菌生化鉴定结果

3.3 大肠杆菌16sRNA鉴定结果

肠系膜淋巴结中4 株大肠杆菌致病分离株均可扩增出1 540 bp大小的目的条带。PCR鉴定结果见图3。

图3 大肠杆菌16SrRNA的PCR电泳图

3.4 大肠杆菌毒力基因PCR检测结果

肠系膜淋巴结中1 株大肠杆菌致病分离株检测到K99、Sta、irp2、Eae基因分别在163 bp、314 bp、301 bp、552 bp处有清晰条带，与预期目的片段大小相符（图4）。

图4 分离株毒力基因PCR检测结果

3.5 大肠杆菌药物敏感性试验结果

肠系膜淋巴结中4 株大肠杆菌致病分离株药物敏感性试验结果见表4。

表4 药敏试验结果

4 讨论

不管是奶牛场还是肉牛场，犊牛是牧场发展的基础。而消化道疾病是新生犊牛极易发生的疾病，饲养不当，环境中携带致病菌，犊牛应激导致个体免疫力下降从而发病。应激包括冷热应激等。夏季防暑、冬季保暖，落实新生犊牛初乳饲喂，加强牧场饲养管理，避免犊牛腹泻给牧场带来不必要的损失[3，6，7]。本试验查明该规模化牧场犊牛腹泻的主要因素是大肠杆菌。

大肠杆菌作为环境中的常见菌，其主要致病性由其本身的毒力基因来决定。通常采用PCR根据其毒力基因进行分型，其中ETEC主要检测的毒力基因为K99[8～10]，本试验中的4 株致病菌检测出具有K99基因、Sta基因、irp2基因、Eae基因。

通常大肠杆菌引起的犊牛腹泻使用抗生素治疗为主，为了避免细菌的耐药性，严禁大剂量使用致病菌株不敏感的抗生素，而应使用大肠杆菌高度敏感药物，科学合理地使用抗生素，常用药物有庆大霉素、土霉素等[3，11]。该病要以预防为主，发病时对因治疗[3，12～15]。

本试验结果为肠系膜淋巴结中4 株大肠杆菌致病分离株对头孢曲松、恩诺沙星高度敏感，对链霉素、头孢哌酮、庆大霉素敏感，建议牧场对发病严重犊牛采用生物灌服庆大霉素，并注射恩诺沙星联合治疗，脱水犊牛及时补液。对腹泻症状有所好转的犊牛采用巴杀牛奶中加入黄芪多糖及乳酸菌，提高犊牛抵抗力，治疗效果十分显著。