新疆部分地区奶牛乳房炎大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

2023-01-13贾立敏蔡扩军

中国乳业 2022年12期

贾立敏，蔡扩军，2＊

1 乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐 830063

2 新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛场最常发、最难治，也是危害最大的疾病之一，不仅使产奶量下降，而且影响牛奶质量，带来了食品安全和公共卫生安全隐患，每年给全球奶牛养殖业造成的经济损失高达数百亿美元[1]。引起奶牛乳房炎的病原菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌等，其中大肠杆菌属于人畜共患的条件性致病菌，不但分离率高，而且耐药性强，给奶牛乳房炎的防治带来了困难[2，3]。随着新疆奶牛养殖业的快速发展，奶牛养殖规模不断扩大，截至2021年现存奶牛数超过220万头，已经成为我国重要的奶业基地之一[4]，奶牛乳房炎的防治成为必须要解决的重要问题[5]。为此，本研究采集了新疆5 个地州（市）5 个规模化奶牛场患有乳房炎的乳液样品，并在实验室开展大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验，为大肠杆菌引起的奶牛乳房炎的防治及奶牛产业的高质量发展提供技术支撑。

1 材料

1.1 样品来源

分别在新疆乌鲁木齐、伊犁、喀什、阿克苏、巴州5 个地区的5 个规模化奶牛养殖场采集200 份患有临床型和隐性乳房炎的奶牛乳液样品。

1.2 主要试剂及仪器

Mueller-Hinton琼脂（MHA）、伊红美蓝琼脂（EMB）、EC肉汤，青岛海博生物技术有限公司；细菌药敏纸片，杭州滨和微生物试剂有限公司；大肠杆菌通用型荧光PCR检测试剂，深圳澳东检验检测科技公司；大肠杆菌显色培养基，法国科玛嘉公司，革兰氏染液，珠海贝索生物技术公司；荧光PCR仪、显微镜，赛默飞世尔科技公司。

2 试验方法

2.1 样品采集

以奶牛养殖场已经筛查出来的患有隐性乳房炎和临床型乳房炎的奶牛为采样对象。首先用消毒液对奶牛的乳房和乳头进行清洗及消毒，然后弃去每个乳头的前3 把奶，最后无菌操作将奶样挤入采样瓶中，做好标记，低温运送至实验室。

2.2 细菌分离培养

2.2.1 增菌

在生物安全柜中取25 mL奶样放入三角瓶中，再加入225 mL EC肉汤，放入37 ℃培养箱中培养18～24 h。

2.2.2 分离

将增菌后的EC肉汤用接种环在伊红美蓝琼脂（EMB）平板上划线，随后放入37 ℃培养箱中再培养18～24 h，观察平板上生长的菌落形态。

2.2.3 显色鉴定

将伊红美蓝琼脂（EMB）平板上疑似大肠杆菌的菌落，再次在大肠杆菌显色培养基上划线，放入37 ℃培养箱中再次培养18～24 h。

2.3 革兰氏染色镜检

在无菌载玻片上滴入1～2 滴灭菌水，将大肠杆菌显色培养基上疑似阳性的单个菌落挑取至载玻片上混匀，火焰固定，按照革兰氏染色液试剂盒说明书中初染、媒染、脱色、复染四个步骤进行革兰氏染色，最后将载玻片放入显微镜下镜检。

2.4 荧光PCR鉴定

2.4.1 DNA模板的制备

从符合大肠杆菌镜检特征的平板中，挑取其中的目标菌落放入盛有EC肉汤的试管中，放入37 ℃恒温摇床中培养18～24 h。利用水煮法制备DNA。吸取菌液1～2 mL于1.5 mL EP管，10 000 r/min离心2 min，弃去上清液，加入200 μL DEPC水混匀，在水中煮沸10 min，冰浴5 min，12 000 r/min离心5 min，转移上清液于新的EP管中，即为DNA模板。

2.4.2 反应组分配制

取2 μL样品DNA和23 μL反应体系加至反应管，反应总体积为25 μL，并且设置阴性和阳性对照。

2.4.3 PCR扩增

在荧光PCR仪上设置反应程序，预变性3 min 95 ℃、95 ℃变性5 s、65 ℃退火40 s，40 个循环。

2.5 药敏试验

用麦氏比浊仪将每一个菌株的浓度调至0.5麦氏浊度，然后用灭菌棉签充分蘸取菌液，紧密的涂在MHA平板上，一般不同方向涂4 次即可，再将14 种药敏片贴在涂布好的MHA平板培养基上，随后将贴好药敏片的平板培养基放入37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h，然后用直尺测量抑菌圈的直经，记录结果，并按说明书及CLSI M100-2020第30版进行耐药、敏感的判定。

3 结果

3.1 培养分离显色结果

大肠杆菌在伊红美蓝琼脂培养基上呈现黑色中心有金属光泽或无光泽的菌落，见图1。在大肠杆菌显色培养基上呈现蓝绿色圆形凸起菌落，见图2。

图1 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂上分离培养结果

图2 大肠杆菌在显色培养基上显色结果

3.2 镜检结果

将染色干燥后的载玻片滴入一滴香柏油后放置显微镜下观察，可以观察到红色的革兰氏阴性杆菌，见图3。

图3 大肠杆菌的镜检结果

3.3 荧光PCR鉴定及结果

根据大肠杆菌通用型荧光PCR检测试剂盒说明书进行判定，阳性样品呈现“S”型扩增曲线。结果显示，本次一共检测样品200 份，其中63 份阳性，137 份阴性，阳性率31.5%，阴阳性对照成立，结果见图4。

图4 大肠杆菌的荧光PCR部分检测结果

3.4 药敏结果

14 种药敏片周围出现了不同大小的抑菌圈，根据药敏片说明书及CLSI的折点，判断耐药、中介和敏感，结果发现分离的大肠杆菌对青霉素的耐药率最高，对美罗培南的耐药率最低，见图5。耐药性统计结果见表1。

表1 大肠杆菌的药敏试验结果

图5 大肠杆菌部分药敏结果

4 讨论

细菌的分离培养、革兰氏染色镜检，并结合荧光PCR检测是对细菌进行鉴定有效、可靠的技术方法。直接从牛乳中提取核酸，然后进行大肠杆菌的荧光PCR检测，虽然可以节约分离培养的时间，但由于牛乳中不管死的细菌还是活的细菌都能提取出来细菌核酸，所以用这种办法，大肠杆菌荧光PCR阳性并不确定牛乳中的大肠杆菌是否还有致病性，有可能已经失去了活性。本研究先将大肠杆菌从牛乳中培养分离出来，进行革兰氏染色镜检，并开展荧光PCR检测，这样能保证荧光PCR阳性就是代表牛乳中存在有活性的大肠杆菌，能真实的反映奶牛乳房炎中大肠杆菌分离率和危害性。本研究奶牛乳房炎中大肠杆菌分离率为31.5%，与买尔哈巴·吾斯曼等[2]、常军帅等[6]、刘肖利等[7]报道的分离率较为相符。

养殖环节兽用抗菌药不科学、不合理使用导致动物源大肠杆菌的耐药性不断增加，不但造成治疗效果不佳，增加养殖成本，而且给公共卫生安全带来了严重威胁，已经引起政府相关部门及专家学者的广泛关注，并制定了一系列强有力的举措[8]。2016年我国发布了《遏制细菌耐药国家行动计划》，2017年原农业部印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017—2020年），2021年4月施行了《中华人民共和国生物安全法》，将应对微生物耐药性提高到维护国家安全的战略高度。这些重大措施充分体现了国家对遏制细菌耐药性、保障人民健康的决心。本研究中，从奶牛乳房炎分离的大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、链霉素、多西环素、庆大霉素、复方新诺明的耐药率分别为93.65%、73.01%、53.96%、39.68%、31.74%、31.74%，对其他8 种抗菌药的耐药率均低于30%，其中对美罗培南的耐药率最低为1.58%。同一地区分离的大肠杆菌对不同抗生素的耐药率不同，不同地区分离的大肠杆菌对同种抗生素的耐药性也不同，这与平时治疗、预防奶牛疾病用药直接相关，应通过药敏试验科学规范合理选用抗菌药物，避免盲目用药。值得注意的是，在全国“减抗、替抗”的大背景下，中草药等产品已经逐渐成为防治奶牛乳房炎，尤其是隐性乳房炎的主流。