实验动物质量控制中泰泽病原体的研究进展

陶俊豪, 鄢慧琼, 谢 珲, 应华忠, 戴方伟

(杭州医学院实验动物中心,浙江省实验动物与安全性研究重点实验室,杭州 310013)

泰 泽 病 原 体 （Tyzzer’s organism） 是Ernest Tyzzer［1］于1917 年 发 现 的 一 种 毛 发 状 芽 孢 杆 菌（Clostridium piliforme，旧称Bacillus piliformis），能够感染多种动物，引起肝肠坏死、腹泻及死亡（称为泰泽病）。目前在小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、麝鼠、兔、犬、猫和马等体内均发现过泰泽病原体，此外有关鸟类感染泰泽病原体的案例报告有4 篇［2-5］。Smith等［6］发现一例感染泰泽病原体的人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者，其体内微生物序列与已知的泰泽病原体16 S rRNA序列只有一个碱基对不同，这是迄今人类临床上报告的唯一病例。国内姚菊芳等［7］对与实验动物有密切接触的饲养人员、相关人员和无关人员进行血清学调查，发现密切接触人员的泰泽病原体抗体阳性率（85.7%）高于相关人员（40.5%）和无关人员（22.0%）。泰泽病原体主要呈隐性或者亚临床感染，对实验动物和相关工作人员均存在威胁，国家标准《实验动物泰泽病原体检测方法》（GB/T 14926.10—2001）规定泰泽病原体是清洁级以上动物必须排除的病原体之一。

泰泽病原体是一种严格的细胞内寄生菌，无法在无细胞培养基上培养，只能用鸡胚和选定的细胞系进行体外培养［8］。这极大地限制了对泰泽病原体的研究。目前通常使用已经受感染的实验动物进行泰泽病原体研究。鉴于此，本文从泰泽病原体的生物学特性、流行病学与疾病特征、检测方法与进展以及防治四个方面进行综述，为以实验动物质量控制和生物安全管理为目标的泰泽病原体研究提供参考。

1 泰泽病原体的生物学特性

泰泽病原体是一种厌氧的专性细胞内寄生毛发状芽孢杆菌，有繁殖体和芽孢两种形态［9］。繁殖体呈丝状或粗短杆状。丝状结构的细菌边缘由细胞质膜、中间层和厚度为25～30 nm 的特征性细胞壁组成，富含鞭毛；粗短杆状的细菌内含有许多较小的空泡，细菌外壁边缘可见一层额外的疏松层，厚度约为3.5 nm，完全包围菌体，并与胞质和内质网直接接触，寄主细胞的核糖体与其外围相连［10］。繁殖体在体外易失活，一般以芽孢的形式传播，可通过鞭毛感染另一个宿主细胞。

泰泽病原体最常见的传播方式为粪-口传播，动物一般从受粪便污染的环境中摄入芽孢。垂直传播也是泰泽病原体感染动物的途径之一。泰泽病原体通过细菌导向的宿主微丝依赖机制入侵肠上皮细胞，然后迅速逃脱吞噬小体，以与志贺菌和立克次体相似的方式在细胞质内复制。与其他胞内病原体的区别在于，泰泽病原体富有的周生鞭毛使其能够在细胞内快速运动，并可能侵入细胞核［11］。

泰泽病原体的繁殖体在45 ℃加热15 min即可被杀灭；芽孢能够在56 ℃下存活，在60 ℃加热30 min 灭活，在80 ℃加热15 min灭活。泰泽病原体在－80 ℃能保存数年，其感染力与菌株种类、芽孢数量有关，一般至少需要50～100 个芽孢才能达到半数感染量。甲醛、过氧乙酸、次氯酸钠、碘酚、苯酚可灭活芽孢。

泰泽病原体有多种菌株，不同宿主的菌株具有不同的抗原表位，同一宿主的不同分离株在蛋白质和抗原表型上存在差异，单个鞭毛抗原不能用于感染所有分离株的动物的血清学测试。但各分离株之间均有共同表位，这可能是泰泽病原体为了适应不同宿主所出现的遗传进化［12-13］。

2 泰泽病的流行病学与疾病特征

实验动物兔、小鼠、大鼠、沙鼠等对泰泽病原体均易感。有研究表明，从小鼠体内分离的M 株、大鼠体内分离的R 株以及兔体内分离的K 株对小鼠致病性是相同的［14］。泰泽病原体接种小鼠后，小鼠体内白细胞介素-12 表达上升，自然杀伤（natural killer，NK）细胞和Th1 反应在感染和介导免疫应答过程中发挥了重要作用［15-16］。而且无胸腺的小鼠比有胸腺的小鼠更容易感染泰泽病原体［17］，这可能是由于无胸腺的小鼠免疫力更低。泰泽病原体毒力因子的成分为蛋白质，不同的分离株能引起不同程度的细胞毒性，表明不同的泰泽病原体菌株可以诱导不同的临床表现［18］。

泰泽病的症状一般在动物死亡前不久才出现，而且通常是非特异性的，在个体之间存在差异，但都会出现肝脏和肠道病变。鼠类感染泰泽病原体后，通常会出现肝肠病变，偶尔出现心脏病变及脑炎［3，19］。小鼠对泰泽病原体的易感性随宿主年龄、免疫状态和感染菌株的不同而出现差异。仓鼠和沙鼠在死亡前很少有或无迹象，有一些病例会出现腹泻、肛周粪便污染、抑郁、脱水、毛发粗糙等症状，并且幼年动物无法成长［20］。实验幼兔对泰泽病原体非常易感，临床表现为不同程度的胃肠道症状，体征包括食欲不振、嗜睡、腹胀、盲肠嵌塞、腹泻、脱水等［21］。自发性脑炎是一种罕见的泰泽病表现，在沙鼠和雀形目动物中有报告［2-3，22］。研究还发现，泰泽病原体感染后的沙鼠［22］和普通狨猴［23］的中枢神经系统会发生病变。

对感染泰泽病原体的鼠类进行尸检，发现盲肠和回肠肌层均有多灶性坏死，有多形核细胞浸润，黏膜溃疡旁的上皮细胞和黏膜肌层的平滑肌细胞内可见丛生的细长杆菌，肠系膜内有淋巴细胞浸润；肝脏中可观察到直径达1 mm的白褐色病灶，门脉周围有凝固性肝细胞坏死的多灶性病变，坏死灶含有细胞碎片，轻度多形核细胞浸润，偶见红细胞［19］。在感染最严重时期的大鼠肌间神经丛内通常出现空泡化或缺失，而在病情较轻的动物器官中仅发现肝门管区周围有轻微的淋巴细胞浸润［24］。胃肠道、肝脏和心脏的坏死性和炎性病变是哺乳动物泰泽病的典型病理表现。病变区域和健康区域之间的过渡区很小，由1层或2层部分变性的细胞组成，对碱性和酸性染料的亲和力增强［25］。

泰泽病的发病机制包括摄入泰泽病原体芽孢或繁殖体。动物感染该菌后，首先在回肠-盲肠结肠区域复制，进一步可能到达肝脏，再感染体内其他组织或器官，偶尔也通过体循环到达心脏［26］。肝损伤可导致肝脏氨基酸清除率降低，这可能是代谢性酸中毒的重要因素［27］。肠黏膜上皮损伤与肝脏损伤都可能引起低血糖。

泰泽病一般由多种因素引起，其发病率低，但致死率高。幼年动物特别是当免疫功能受损时最易感。在小型哺乳动物体内，潜伏期一般为2～10 d。Fries［28］通过对小鼠、大鼠和兔体液抗体应答的长期观察发现，该病原体可能以持续或潜伏感染的形式存在于动物体内，并持续刺激免疫系统，动物对感染的抵抗力与抗体效价有关。泰泽病原体的感染力和致病力与宿主的种属、健康状况、周龄、性别、饮食和机体免疫，以及宿主所处的周边环境均有密切关系。过度拥挤、卫生条件差和皮质类固醇治疗等因素可诱发泰泽病。

Ganoe等［29］认为，泰泽病可能是在过去50年里导致北美麝鼠数量显著下降的原因之一。研究还发现泰泽病原体在啮齿类实验动物体内具有较高的检出率。冯丽萍等［30］、潘金春等［31］和魏杰等［32］分别对2010—2013年上海市、2013—2015年广东省和2009—2013年北京市实验大鼠、小鼠的病原体感染情况进行检测，结果显示，各年度均能检出泰泽病原体。戴方伟等［33］对普通环境饲养的长爪沙鼠病原感染情况进行初步调查，泰泽病原体检出率为6.7%。北京市及浙江省的地方标准已经将泰泽病原体列入清洁级长爪沙鼠必检项目之一。

3 泰泽病原体的检测技术及其进展

泰泽病原体的检测方法有很多，如组织病理学诊断、可的松激发试验、悬液芯片技术、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫荧光法（immunofluorescence assay，IFA）、聚合酶链式反应（polymearse chain reaction，PCR）等，但都存在一定的缺陷［34］。例如，2001 年发布的国家标准（GB 14926.10—2001）将可的松激发试验作为参考方法，此法以发病动物特有的病理改变及镜下检出泰泽病原体为依据，结果准确可靠，但操作繁琐；组织病理学诊断也存在相似的缺点。

何静云等［35］于2006 年证明，免疫磁珠分离技术可有效地分离和纯化泰泽病原体，为特异性ELISA 诊断抗原的制备奠定了基础。2008 年国家标准（GB 14926.10—2008） 将可的松激发试验删除，IFA 和ELISA两种方法被用来进行泰泽病原体诊断。ELISA具有简单、可靠、准确性高的优点，但对窗口期或隐性感染动物易漏检；IFA 方法虽简单易行，但由于梭菌与泰泽菌有交叉反应，可能存在非特异性结合导致的假阳性。ELISA和IFA都存在检测灵敏度低、检测方法成本高等问题。由于泰泽病原体的分离培养较为困难，ELISA 等方法的假阳性率较高，因此一般采用对患病动物的器官组织切片后通过银染或May-Giemsa染色来确认该菌。

Niepceron 等［36］在2010 年建立了一种特异性强的巢式PCR 检测法。该方法适用于临床标本，包括盲肠内容物和肝脏，也可应用于设备简单的实验室进行泰泽病的常规诊断。丁聪等［37］采取ELISA和IFA并结合巢式PCR 法对实验大鼠中泰泽病原体的携带情况进行调查，发现ELISA 和IFA 敏感性要高于PCR，提出采用IFA 与ELISA 相结合的方法可提高检测结果的敏感性及可靠性。冯洁等［38］对已建立的泰泽病原体巢式PCR 检测方法进行优化，并将优化后的巢式NPCR 与IFA 相比，发现优化后的方法具有较高的特异性和灵敏度。PCR 或反转录PCR 等分子检测方法可以克服其他检测方法的局限性［39］，具有高特异性，能区分密切相关的非致病株和致病株的感染性病原体，但新菌株的引物位点的微小变化可能会导致假阴性，并且PCR的高敏感性可能会产生假阳性。

赵婷婷等［40］根据泰泽病原体16S rDNA 保守基因组序列设计引物和特异性探针，建立反向斑点杂交方法。张超超等［41］采用悬液芯片技术进行实验兔中包括泰泽病原体在内的常见病原体检测，该方法具有快速、微量、特异、敏感性高等优点。Tosa 等［42］建立了泰泽病原体、鼠肝炎病毒和仙台病毒（又称日本血凝病毒）的多重免疫层析检测法，此方法快速简便，能够同时且特异地检测多种抗原的抗体，但试纸的制备费时费力，许多实验室可能缺乏必要的试剂和技术。

另外，由于泰泽病在早期很少出现症状，出现症状后动物很快就会死亡，因此开发一种早期诊断技术对泰泽病的防治至关重要。有研究者采用实时荧光PCR 法分析废气粉尘样本的方法检测小鼠嗜肺巴斯德杆菌［43］和诺如病毒（MNV）［44］，结果显示该方法优于传统的污秽垫料哨兵监测法［45］，这为泰泽病原体检测提供了新的思路。环介导等温扩增技术（loopmediated isothermal amplification，LAMP）具有灵敏性高、特异性强等优点，将其与胶体金技术结合对泰泽病原体的早期诊断可起到重要作用。生物传感器技术、重组酶聚合酶扩增技术和生物成像发光技术等的高速发展，也为泰泽病原体检测带来广阔的前景。

4 泰泽病的防治

泰泽病原体的感染是由多种因素导致，目前还没有针对泰泽病原体的疫苗，对泰泽氏病的治疗尚不完善。由于该病发病迅速，在发现时动物往往很快就死亡，因此难以进行早期的诊断治疗。目前，仅有两例报告［27，46］通过静脉注射葡萄糖、广谱抗生素、抗菌和抗炎药物成功治疗泰泽病原体感染的马；但大多数情况下通过静脉注射药物的方法使患有疾病的幼马短暂性好转后，还会很快恶化，最终死亡［46］。一般认为，四环素对泰泽病有部分疗效，而氯霉素治疗需要大剂量［47］。有研究者认为，针对泰泽病原体这类细胞内寄生型病原体的治疗药物研发，可参考同样作为胞内寄生菌的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和布鲁杆菌（Brucella）［48］。例如，结核分支杆菌的治疗药物贝达喹啉是针对ATP 合成酶［49］；Q203 则属于咪唑并吡啶类化合物，可作用细胞色素bcl 复合物，抑制ATP合成，影响结核分枝杆菌的能量代谢［50］。上述两种药物均可为泰泽病的治疗提供参考。

监测潜在的带菌动物，如沙鼠和仓鼠等啮齿动物，是一项预防泰泽病的重要措施。一旦发现动物被感染，芽孢很可能会在个体之间快速转移，因此对小鼠和大鼠的感染群体应及时进行生物净化或淘汰处理。在实验动物的日常饲养工作中，预防泰泽病的具体措施包括：使用含氯、含碘消毒剂进行消毒，制定严格的洗手规章制度，增加更换防护用品的频率，改变动物的喂食顺序和清洗顺序，对进出饲养地的人员进行严格限制和培训管理［51］。

5 展望

近年来，针对泰泽病原体的工作主要集中于检测技术开发、临床症状、病理特征研究和疾病治疗方面，而基础性研究并不多见。例如，关于泰泽病原体基因组方面的研究尚未见报告。另外，泰泽病原体难以进行人工培养和分离纯化，致使其深入研究相对困难。而且，由于无法体外获得大量纯化的抗原，使得国内泰泽病原体检测试剂盒的生产面临困境，进口试剂盒供应虽能暂时缓解国内检测材料供不应求的现状，但在新冠病毒肺炎全球大流行的环境下，进口试剂采购的不便性势必会对检测工作产生不利影响。因此，泰泽病原体基因组序列的确定是研究泰泽病原体生物学特性的理论基础，人工培养泰泽病原体的体系优化也是必须要解决的难题之一，在此基础上才能为其生物学特性研究及疫苗研制等工作奠定基础，从而减少泰泽病原体感染，避免不必要的经济损失，保证我国实验动物科技事业稳步健康发展。

[作者贡献Author Contribution]

陶俊豪和鄢慧琼检索和整理文献，撰写文章；谢珲对文章框架及内容进行修改，并提供重要意见；应华忠提供资金，对文章内容进行检查并提出意见；戴方伟修改文稿，提供资金。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。