动物模型在Eph家族蛋白功能研究中的应用

胡耀华, 赵菊梅, 师长宏

(1. 延安大学医学院,延安 716000; 2. 空军军医大学实验动物中心,西安 710032)

受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）参与细胞生长发育的各个阶段，并与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。多种酪氨酸激酶靶点在开展癌症治疗、预测评估耐药机制等领域发挥重要作用。促红细胞生成素诱导肝细胞激酶（erythropoietin-producing hepatocyte kinase，Eph）作为家族成员最多的RTK，同样具有广泛的临床应用价值［1］。该家族与传统RTK的不同之处在于其同源配体也是一种膜定位分子。因此，Eph 受体和配体通常介导相同或不同类型细胞间的接触依赖性转导信号，以调控细胞的形态、粘附、增殖、血管生成、分化等细胞生物学行为，在肿瘤的进展中发挥重要作用［2］。目前，细胞模型和各类动物模型的应用极大促进了Eph 家族相关基础研究。在具体研究过程中，研究者根据实验目的正确选择实验模型对探讨Eph 家族相关分子的功能及靶向药物的研发至关重要。据此，本文针对在Eph 家族分子功能研究中，如何选择合适的动物模型以及不同模型的优缺点进行归纳总结，以期为Eph家族的基础研究提供参考。

1 Eph家族的结构特点及功能

Eph家族包括Eph受体和Ephrin配体，是已知的家族成员最多的RTK。该家族参与调节细胞迁移、聚集、靶向等多种生理效应，在神经轴突导向、血管生成及肿瘤形成等方面发挥重要作用［1］。根据Eph 家族成员同源性、表达、分布和结构等的不同可细分为受体EphA、EphB 及配体EphrinA、EphrinB 两个亚类［2］。Eph 受体亚家族共有16 个成员，包括EphA（1～10）以及EphB（1～6），其胞外区由一个N端球状结构域、一个富含半胱氨酸的结构域和两个纤连蛋白Ⅲ组成。胞内包含具有酪氨酸激酶活性的结构域、不育α 基序（sterile alpha motif，SAM）结构域和C端的突触后致密蛋白结合区域（post-synaptic density protein，discs large，zona occludens，PDZ）结构域［2］。Ephrin 配体的结构则有明显的不同，包含通过糖脂磷脂酰肌醇连接方式结合到细胞膜上的EphrinA1～5以及含有跨膜区和胞质区的EphrinB1～3［2］。Eph受体及Ephrin配体最主要的3 个基本特征是：（1）两者都是膜定位分子；（2）虽有证据表明两者存在可溶性形式，但其相互作用依赖细胞之间的直接接触［3］；（3）两者都能传导信号到宿主细胞，产生双向信号，这种双向信号包括Eph 受体产生的正向信号以及Ephrin 配体产生的反向信号。同时，受体、配体的定义不是一成不变的，因为受体能充当配体，反之亦然。介于Eph 家族复杂的表达模式，随着研究的不断深入和发展，针对不同的Eph 功能研究相关的动物模型层出不穷。目前广泛使用的模型包括异种移植瘤模型、肿瘤免疫治疗模型、基因修饰小鼠模型等，不同模型在肿瘤侵袭、迁移、血管生成、耐药等多种恶性生物学行为的研究中发挥重要作用。

2 异体移植瘤模型在Eph研究中的应用

人源肿瘤细胞系异种移植（cell line derived xenograft，CDX）模型、原代肿瘤细胞模型（patientderived cell models，PDC）模型和人源肿瘤组织来源移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型均属于异种移植瘤模型。它们均以免疫缺陷鼠为受体。CDX 模型是将体外培养的肿瘤细胞通过皮下注射、腹腔注射、尾静脉注射的方式移植到免疫缺陷小鼠体内构建的肿瘤动物模型；其特点是易于形成肿瘤，构建周期短；大多数基因功能的体内验证、分子机制的探究都以该模型为基础，但该类模型缺乏原肿瘤的分子特征及异质性［4-5］。将来源于患者的细胞或临床新鲜的手术标本移植到小鼠体内建立的PDC、PDX 模型，含有源自患者的基质细胞和免疫细胞［6］，保留了原发肿瘤组织的病理学特征，可代替患者用于药物的筛选、新疗法的研发，但其移植成功率低，构建周期长。研究者利用上述模型重点探索了Eph 家族分子在肿瘤转移、血管生成和耐药形成中的作用。

2.1 基于异种移植瘤模型研究Eph在肿瘤转移中的作用

大量体内外实验证明，Eph 的异常表达与肿瘤的转移相关。为了阐明EFNA4（即EphrinA4）在肝癌发生中的生物学功能及相关分子机制，Lin 等［7］将过表达EFNA4的肝癌细胞注射到裸鼠的肝脏，构建CDX模型。结果表明，EFNA4 过表达促进了肝癌细胞的上皮间质转化和肿瘤转移。同样在结直肠癌中，Dopeso等［8］敲低CDX 模型中的EphB4 后，结直肠肿瘤增殖、侵袭、转移能力增加。上述Eph 的研究通常是在单个受体或配体上进行，主要用于证实受体或配体单独表达对肿瘤转移的作用。值得注意的是，有证据表明，在前列腺癌中，EphA2 与配体相互作用能够介导运动接触抑制，进而抑制肿瘤的侵袭、迁移［9］。然而，当EphA2独立存在时，它可以转化为促癌蛋白，通过Akt磷酸化促进肿瘤细胞迁移和侵袭［10］。据此，Astin等［9］归因于Eph家族复杂的信号传导系统，Eph受体、配体以依赖或非依赖形式介导双重作用。然而仍存在一个关键问题，这种模式在体内是否依然存在，为此需构建动物模型，探讨Eph-Ephrin 系统对肿瘤功能的影响。

Qazi等［11］用从脑肿瘤患者收集的细胞建立了PDC模型，证实EphA2 和EphA3 受体共同驱动脑肿瘤复发和转移，提高肿瘤细胞的克隆形成和增殖能力。王洁等［12］通过皮下移植建立14 例胃癌PDX 模型，进一步原位移植成功建立3例胃癌PDX模型，最后通过PCRArray 筛选出3 个与胃癌转移显著相关的基因，其中就包括了EphB2。

2.2 基于异种移植瘤模型研究Eph在血管生成中的作用

血管生成是一个高度复杂的协调过程，在正常发育和多种疾病进展的病理生理学过程中起着关键作用。Eph 家族分子同样在肿瘤血管生成中扮演重要角色，目前研究其功能的动物模型大多聚焦在CDX 模型。例如，在结直肠癌中，Lv 等［13］通过稳定敲低和过表达EphB4 建立CDX 模型，并使用对照细胞系研究了EphB4 在结直肠癌中的作用，结果表明结直肠癌异种移植肿瘤中的微血管密度与EphB4 显著相关，EphB4作为与增殖和血管生成相关的肿瘤启动子，可能是潜在的结直肠癌治疗靶点。Sato等［14］为了确定头颈部鳞状细胞癌中EphB2 表达是否调节血管生成，将敲低或过表达EphB2 的OSC19 细胞注射到裸鼠的舌头中，与对照组和EphB2-KD组肿瘤相比，EphB2-OE OSC19肿瘤中的血管密度显著增加，提示高表达的EphB2 促进肿瘤血管生成。在前列腺癌中，Li 等［15］敲低EphA6的表达建立CDX 模型，体内血管生成实验结果表明，低表达的EphA6 抑制血管生成。Neuber 等［16］给裸鼠皮下注射过表达EphB4 的A-375 细胞，构建人黑色素瘤的CDX 模型，体内和离体荧光成像结果表明，Eph抑制肿瘤血管生成。Festuccia 等［17］基于Eph-Ephrin系统的开发寻找新的抗肿瘤策略，引入一种靶向Eph/Ephrin相互作用的小分子UniPR1331，其在脑胶质瘤的裸鼠异种移植和原位癌模型中均抑制血管生成，具有显著的抗肿瘤活性。

2.3 基于异种移植瘤模型研究Eph 在耐药中的作用

原发及继发耐药是肿瘤治疗过程中迫待解决的关键问题，而研究耐药相关机制就必须对关键分子进行探索。越来越多的化疗药物通过肿瘤细胞实验、CDX模型、PDX 模型来进行验证，结果发现部分Eph 家族分子可作为有前景的药物靶点，且在不同类型的恶性肿瘤中发挥重要作用。Miao 等［18］通过生物信息学分析、细胞实验和CDX 模型证实，EPHA2 抑制剂ALWII-41-27 和HG-6-64-1 可有效抑制耐威罗非尼（vemurafenib tablet，VEM）的黑色素瘤细胞增殖；同样，作者构建了人黑色素瘤细胞A-375 的裸鼠CDX 模型并连续40周使用顺铂治疗，发现EphB4过表达与肿瘤细胞对顺铂产生耐药性有关。此外，顺铂与EphB4选择性抑制剂的组合可以削弱这种获得性耐药机制［19］。为真实模拟临床，Leung 等［20］将临床新鲜的肝癌手术标本移植到BALB/c裸鼠皮下建立肝癌PDX模型，通过持续对裸鼠使用索拉菲尼灌胃，构建耐索拉菲尼的PDX模型，利用该模型进行RNA测序分析，确定EphB2 是上调最显著的激酶；在此基础上进一步确定EphB2/β-catenin/TCF1 的正反馈通路增强了肝癌的肿瘤细胞干性和索拉非尼耐药性，揭示其可能是抗肝癌耐药的有效治疗策略。而Toosi 等［21］分别采用相应的乳腺癌CDX和PDX模型对体外细胞学实验进行体内验证，结果表明沉默EphB6 促进了肿瘤的生长，增加了乳腺癌对多柔比星的耐药性。

随着药物联合治疗方案的优化及给药系统的完善，pH敏感性脂质复合物、线粒体靶向偶联物等新型给药途径在提高药物疗效、降低药物毒性以及特异靶向肿瘤部位等多方面发挥重要作用。Zhang等［22］设计了一种兼具pH敏感性和主动靶向性的多功能给药系统，成功获得具有良好理化性质的EphA抗体偶联多柔比星的脂质复合物。为了验证其效能，该研究建立了人乳腺癌细胞MCF-7的CDX模型，分组注射不同剂型的脂质复合物，结果表明脂质复合体对MCF-7细胞具有良好的细胞毒性作用，并克服了多药耐药效应。同样在人乳腺癌细胞MCF-7 的CDX 模型中，Zhang 等［23］进一步评估了不同制剂的抗肿瘤活性，证实一种新型的线粒体靶向偶联物三苯基膦-多西他赛融合脂质体（EPSLP/TD）的制剂能够有效地将抗肿瘤药物递送到肿瘤细胞的线粒体，并诱导线粒体介导的细胞凋亡。这些结果提示，应用动物模型评估新型给药方式对逆转化疗药物耐药、提高晚期患者的存活率具有重大意义。

总之，Eph-Ephrin 系统在癌症转化和进展的每个阶段都发挥作用，它可以成为筛查、预后评估和治疗的有效工具，但由于其复杂的表达模式、双向信号系统的传导及其他系统的串扰，Eph 的研究错综复杂，仍有待进一步深入探讨。异种移植模型的建立和应用为探究Eph家族分子创造了良好的条件。

3 肿瘤免疫治疗模型在Eph研究中的应用

肿瘤免疫治疗模型的应用推进了肿瘤相关免疫、干细胞等方面的研究。不同种类的肿瘤免疫治疗模型可移植不同的肿瘤或细胞，特别是重度联合免疫缺陷的NSG 小鼠能够植入正常或癌变的人类细胞或组织，为人源化研究提供良好的实验工具。例如，移植人类免疫细胞，包括人外周血单核细胞［24］或造血干细胞［25］，使小鼠拥有部分人类免疫功能，兼具评价免疫治疗效果、免疫调节剂的作用，在肿瘤免疫创新药物研发中有着广泛的应用前景。此外，有研究人员将PDX肿瘤与患者来源的免疫细胞相结合［26］，实现了精准的个体化免疫治疗研究。

以免疫检查点（immune checkpoint）抑制剂和嵌合抗原受体T 细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）治疗为代表的新型免疫疗法开启了肿瘤免疫治疗的新方向。大量研究表明，Eph家族分子在单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种免疫细胞中异常表达［27-29］，且在细胞发育、分化、激活和增殖中发挥关键作用。因此，NOD-SCID、NCG/NSG/NOD 等免疫功能缺陷相关小鼠模型在Eph研究中具有独特的用途。NOD-SCID 小鼠具有T细胞、B细胞缺陷，先天免疫水平低，模型构建周期短，重复性好，适用于多种肿瘤细胞移植，但不适于长期实验［30］。NCG/NSG/NOD 小鼠在NOD-SCID 基础上敲除IL-2Rg基因，在缺失T细胞、B细胞的同时缺少NK细胞，免疫缺陷程度更高；此类小鼠建模成功率高，稳定性好，经过传代后仍能保持原代肿瘤的异质性，可用于长期实验［31］。第一个被鉴定为肿瘤相关抗原的Eph 分子是EphA2［32］，它在包括黑素瘤在内的多种恶性肿瘤中过度表达。随后证实EphA2 受体在人CD4+T 或CD8+T 细胞中有多个识别位点［33-34］，是Eph家族中研究最广泛的肿瘤相关抗原。

3.1 基于肿瘤免疫治疗模型研究Eph在疫苗制剂中的作用

肿瘤相关抗原-树突细胞（dendritic cells，DCs）因其可诱导肿瘤抗原特异性细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T cell，CTL）和辅助T细胞而成为强有力的抗癌工具［35］。Yamaguchi等［36］以C57BL/6小鼠为研究对象，腹腔注射抗CD4 抗体、抗CD8 抗体、自然杀伤（natural killer，NK）细胞抑制剂抗asialo GM1 抗体，构建T细胞和NK细胞双缺乏的结直肠癌免疫相关小鼠模型，用于评估接种EphA2 衍生肽（Eph-DCs）疫苗的抗肿瘤免疫治疗情况；结果显示，EphA2 阳性小鼠的免疫治疗效果更好，抑瘤作用更强，提示Eph-DCs疫苗对EphA2 阳性的肿瘤具有特异的杀伤力。此外该团队进一步证明Eph-DCs 疫苗对肝肿瘤细胞的再次攻击具有长期的免疫效果［37］。上述证据表明，基于肿瘤免疫治疗模型获得的肿瘤相关抗原-DCs 疫苗的新策略有望提高晚期癌症患者的临床疗效。

3.2 基于肿瘤免疫治疗模型研究Eph在CAR-T细胞治疗中的作用

CAR-T 细胞疗法的基本原理是利用患者自身的免疫细胞来清除癌细胞［38］。许多肿瘤相关抗原的CART 细胞已在动物模型上验证并用于临床治疗。动物模型在CAR-T细胞的有效性和安全性等研究中具有重大意义。

Chow等［39］开发了EphA2特异的嵌合抗原受体，T细胞能够在体外识别和杀伤EphA2 阳性的成神经胶质细胞瘤，并在成神经细胞瘤原位异种移植的SCID小鼠模型中诱导肿瘤消亡。此外，在非小细胞肺癌中，EphA2 特异的嵌合抗原受体能识别杀死EphA2 阳性的肺癌细胞［40］，同时在SCID 小鼠肺癌模型中，同样证明EphA2-CAR-T疗法有明显的抗肿瘤作用。在食管鳞状细胞癌中，研究者构建了EphA2-CAR-T细胞，发现该CAR-T 细胞具有剂量依赖性的细胞杀伤作用［41］。尽管CAR-T 细胞疗法在临床疗效上取得了重大突破，但是CAR-T 细胞的处理方式、靶抗原亲和力、T 细胞的数量和质量等均影响CAR-T细胞的抗肿瘤效率，且目前尚缺乏评估CAR-T 抗肿瘤效率的标准［42］。针对此现象，An 等［43］选择NOD-SCID 小鼠构建脑胶质瘤异种移植模型，探讨影响EphA2-CAR-T细胞抗肿瘤效率的相关因素，发现较高水平的γ-干扰素（interferonγ，IFN-γ）和趋化因子受体1/2（chemokine receptor 1/2，CXCR1/2）与较差的抗肿瘤活性相关，提示IFN-γ和CXCR1/2组合是评估CAR-T细胞抗肿瘤效率的关键因素。EphA2-CAR-T细胞的发现与构建为肿瘤免疫治疗开辟了新的途径。随着科研成果的积累，相信更多的Eph相关的CAR-T疗法将应用于临床治疗。

3.3 基于肿瘤免疫治疗模型研究Eph在免疫联合治疗中的作用

针对程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）/程序性死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）设计的免疫检查点抑制剂成为近年来肿瘤治疗领域的重大突破。最近Eph 靶向化学药物联合免疫治疗取得了显著的临床疗效。Kamoun 等［44］选用BALB/c、A/J、C57BL/6 小鼠腹腔注射抗CD8 抗体，构建CD8+T 缺陷的乳腺癌小鼠模型，发现靶向纳米脂质体紫杉烷制剂（EphA2-ILs-DTXp）与免疫检查点抑制剂协同，增加了CD8+T细胞活性，从而抑制肿瘤生长。为进一步了解PD-L1 的调控机制，Yang 等［45］选用T、B、NK 细胞缺乏的NOD-SCID 小鼠建立乳腺癌模型，证实EphA10 阻断剂不仅可以通过阻断PD-L1/PD-1 信号转导来增强CTL 活性，而且可以增强CTL 向肿瘤组织的浸润，揭示EphA10作为免疫治疗新靶点具有极大的潜力。上述内容以鼠源的免疫系统为研究基础，不能模拟人的实际情况。而人源化小鼠模型解决了这一问题，可用于人类生物学研究和临床治疗方案的开发，同时能更好地探讨Eph相关免疫制剂的研发。Eph家族分子是极具希望的免疫治疗的靶点，尽管会面临一些问题，诸如在不同的环境下，Eph 信号转导具有双重作用，受体配体产生的正向、反向信号在同一功能的研究中可能产生相同或完全相反的作用，且Eph 家族成员众多，同一受体可与多种配体结合，其表达模式复杂，研究冗杂，但该家族高度保守的进化序列为以Eph 为基础的免疫疗法的开发和动物模型验证创造了机会。

4 基因修饰小鼠模型在Eph研究中的应用

基因修饰小鼠（genetically modified mice）同样为Eph 关键分子的功能研究提供了良好工具。基因修饰小鼠是通过基因敲除、基因突变等手段对小鼠基因进行改造而建立的肿瘤模型，该模型为潜在癌基因、药物靶点的验证、肿瘤免疫治疗、目的基因在体研究开创了新策略。但该类小鼠模型构建周期长、工作量大、成本高。Fawal等［46］构建了人脑类器官（patientderived organoids），寻找抑制脑肿瘤起始细胞自我更新、分化等的可能途径，结果发现用重组配体EphrinB1-FC 激活EphB 受体会降低二氢叶酸还原酶的表达，影响脑肿瘤起始细胞的自我更新及分化能力。Mateo-Lozano 等［47］通过一系列的体外实验发现，EphB6 并不调节结直肠癌细胞粘附、迁移，但EphB6缺失可以调节肿瘤发生、发展；构建EphB6 敲除小鼠模型后证明，EphB6 缺失确实能促进结直肠癌的转移与扩散。在髓母细胞瘤中，先前的研究表明EphA4、EphA7 受体以及EFNA5 配体介导肿瘤细胞的迁移。在此基础上构建EphA4、EphA7 双基因敲除小鼠模型，探讨EphA4 和EphA7 缺失对髓母细胞瘤的影响及其与p-Akt 水平的相关性，结果发现单独敲除EphA4、EphA7 或联合敲除并不影响髓母细胞瘤的生长，但与Akt 磷酸化水平密切相关［48］。Jackson 实验室研发了一种C57BL/6J-Epha4rb-2J/GrsrJ 小鼠突变体，通过限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术获得该小鼠突变体中基因缺陷的详细信息，为拓展EphB4 的功能研究奠定了基础［49］。如上所述，基因敲除是使动物体内某种正常的基因失活，观察该基因不表达会对个体产生哪些影响。而基因突变是确定某一未知基因与疾病的关系。两种基因编辑动物模型均可以推动特异性Eph 所致疾病的研究，直观反映其在体内的功能。

5 总结与展望

综上所述，利用异种移植模型、肿瘤免疫治疗模型和基因修饰小鼠模型，研究者不仅揭示了单个Eph受体或Ephrin 配体调控肿瘤的相关分子机制，而且以上述三种模型为基础可以探讨多个受体或多个配体相互协调的复杂信号通路，验证多个Eph 共同靶向的生物学功能及靶向治疗。但仍存在一些关键问题，包括如何提高移植成功率、如何加快建模进程、如何优化保存条件、减少微生物感染等。总之，选择合适的动物模型，或将多种模型联合应用，以及类器官等其他模型的佐证，可能会更加准确地阐明Eph 复杂的信号转导通路，揭示疾病发生发展的相关机制。

[作者贡献Author Contribution]

胡耀华采集整理文献，设计文章框架，并进行文章撰写；赵菊梅和师长宏修改文章关键性问题并审核定稿。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。