葶丹黄复方对异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚大鼠ERK1/2信号磷酸化的影响

尹 宝 谭向宇 吕志达 刘琛琛 安 炎 姜晓桐

(1 淄博市中医医院 山东 淄博 255300 2 齐鲁医药学院 山东 淄博 255300)

心肌肥厚是心衰、冠心病、心律失常等诸多心血管疾病的独立危险因素[1]。心肌肥厚在细胞水平上表现为心肌细胞肥大、蛋白质合成增加和胚胎基因激活[2]。ERK1/2是丝裂酶原激活蛋白激酶(MAPK)的主要成员之一，ERK1/2被激活后入核并使Elk-1、c-fos、p53、GATA4等转录因子磷酸化，进而调控相关基因的表达促进心肌细胞生长和繁殖[3]，可导致心室出现明显的向心性肥厚[4]。本研究拟基于ERK1/2信号通路探讨葶丹黄复方的抗心肌肥厚作用及其机制。

1 材料和方法

1.1实验药物

葶丹黄复方(葶苈子20 g、酒丹参15 g、生黄芪30 g、法半夏10 g、陈皮10 g、茯苓10 g、炙甘草3 g)由淄博市中医医院科研中心提供，经称重、浸泡、煎煮3次，浓缩至1.029 g/ml(含生药)。卡托普利片购自山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司。

1.2动物

雄性SD大鼠，SPF级，体重200-250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK (湘) 2013-0004，饲养于齐鲁医药学院重点实验室实验动物中心。

1.3试剂

异丙肾上腺素(货号：I5627-5G)购自美国Sigma-Aldrich公司，HE染色试剂盒(货号：G1120)购自北京索莱宝科技有限公司，BCA蛋白定量检测试剂盒(货号：PA115-02) 购自北京天根生化科技有限公司，Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗体(货号：4370S)、p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体(货号：9102S)、β-Tubulin (货号：2128S) 抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.4方法

36只雄性SD大鼠随机分为6组：正常组、模型组、葶丹黄复方(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)和卡托普利组(0.02 g/kg)，每组6只。各组(除正常组)大鼠背部皮下注射异丙肾上腺素1 mg/kg，每日1次，连续10 d；正常组大鼠背部皮下注射等剂量的生理盐水。自由进食，饮水。于造模次日，各治疗组开始给予相应药物灌胃，连续14 d。给药量按照《药理实验方法学》[5]所示体表面积剂量换算法计算，葶丹黄复方和卡托普利分别给予成年人0.5倍、1倍、2倍和1倍的等效剂量，正常组、模型组灌胃以相同体积的生理盐水。

1.4.1心脏重量指数的测定

末次给药后禁食、不禁水12 h，称重，10%水合氯醛麻醉(0.35 ml/100 g, i.p.)，腹主动脉采血后取心脏，生理盐水洗净，冰上去除心房组织、分离左右心室，滤纸吸干后，称量左心室重、全心重。计算左心室重量指数(LVMI) = 左心室重量(mg)/体重(g)，全心重量指数(HMI) = 全心重量(mg)/体重(g)。

1.4.2心肌细胞表面积的测定

4%多聚甲醛固定左室心肌组织，经脱水、浸蜡、包埋、切片(4 μm)后，按照HE染色试剂盒说明书行HE染色。400倍光镜视野下观察心肌细胞形态并拍照，每张切片随机采取三个视野。用Image-Pro Plus 6.0软件测量图片中心肌细胞的表面积，每张切片随机测量30个心肌细胞。

1.4.3 Western blot检测Phospho-ERK1/2(p-ERK1/2)、ERK1/2蛋白表达

严格按照BCA蛋白定量试剂盒说明书定量分装50 μg心肌组织蛋白样本。上述样本经10%分离胶电泳后转膜、封闭。孵以p-ERK1/2、ERK1/2抗体后行化学发光。β-Tubulin抗体作为内参使用。

1.4.4实时荧光定量 RT-PCR检测ANP、BNP mRNA表达

用TRIzol提取心肌组织中2 μg RNA样本，按照试剂盒说明书操作，将RNA样本反转录成cDNA，之后行RT-PCR检测。相关引物如下：ANP(产物369 bp)：上游：5’- GATCTGATGGATTTCAAGAACCTG -3’，下游：5’- CAGATTTGGCTGTTATCTTCGGT -3’；BNP(产物252 bp)：上游：5’- AACAATCCACGATGCAGAAGC -3’，下游：5’- ACAACCTCAGCCCGTCACAG -3’；GAPDH(产物96 bp)：上游：5'- GTGAAGGTCGGAGTCAACG -3'，下游：5'- GGTGAAGACGCCAGTGGACTC -3'。

1.4.5统计学分析

2 结果

2.1 葶丹黄复方对大鼠心脏重量指数的影响

表1 葶丹黄复方对大鼠心脏重量指数的影响

2.2 葶丹黄复方对大鼠心肌细胞表面积的影响

图1 葶丹黄复方对大鼠心肌细胞形态学的影响(×400)

图2 葶丹黄复方对大鼠心肌细胞表面积的影响

2.3 葶丹黄复方对大鼠ERK1/2信号磷酸化水平的影响

图3 葶丹黄复方对p- ERK1/2、ERK1/2、β-Tubulin

图4 葶丹黄复方对ERK1/2信号磷酸化水平的影响

2.4 葶丹黄复方对大鼠胚胎基因ANP、BNP mRNA表达的影响

图5 葶丹黄复方对大鼠胚胎基因ANP、BNP mRNA表达的影响

3 讨论

心肌肥厚是诸多心血管疾病的独立危险因素[1]，在细胞水平上表现为心肌细胞肥大、蛋白质合成增加和胚胎基因激活[2]。高血压是导致心肌肥厚的主要疾病[6]，长期外周血压升高会导致心肌代偿性肥厚，最终导致心力衰竭的发生[7]。本研究结果显示：与正常组比较，模型组的LVMI、HMI、心肌细胞表面积均明显升高，差异均具有显著性(P < 0.05)。提示异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚动物模型造模成功、模型组大鼠已形成心肌肥厚。与模型组比较，葶丹黄复方组(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)和卡托普利组的上述各项指标均有不同程度的降低，葶丹黄复方组10.29 g/kg组的上述各项指标始终存在显著性差异(P < 0.05)。该研究结果提示葶丹黄复方具有有效的抗心肌肥厚作用，且效果优于卡托普利。

有丝分裂蛋白激酶信号通路(MAPKs)是心肌肥厚的经典信号通路[8]，ERK1/2信号转导通路与压力超负荷性心肌肥厚的形成密切相关[3]。本研究结果显示：与正常组比较，模型组的p-ERK1/2 / ERK1/2比率以及ANP、BNP mRNA水平均明显升高，差异均具有显著性(P < 0.01)。与模型组比较，葶丹黄复方组(5.15 g/kg、10.29 g/kg、20.58 g/kg)的上述各项指标均有不同程度的降低，葶丹黄复方组10.29 g/kg组的上述各项指标始终存在显著性差异(P < 0.05)。该实验结果提示：葶丹黄复方可以抑制ERK1/2的磷酸化，下调胚胎基因ANP、BNP mRNA的表达。

以此推断，葶丹黄复方可能通过调控MAPK信号转导通路、抑制ERK1/2的磷酸化，进而下调胚胎基因ANP、BNP mRNA的表达，最终实现其抗异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚作用。