碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌基因型检测研究

万会林 曹小利 王小梅 韩亚飞 孔燕 赵丹妹 诸君

肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于哺乳动物鼻咽和胃肠道中，是导致医院感染发生的主要病原菌之一[1]。碳青霉烯类抗菌药物是临床抗感染常用药物，包括亚胺培南、美罗培南、多尼培南等，其抗菌活性较强、抗菌谱较广，且毒性较低，在治疗革兰氏阴性杆菌中具有重要应用价值[2]。然而由于碳青霉烯类抗菌药物的滥用及不合理使用，导致病原菌对该类药物的耐药性不断增强，并导致碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)形成[3]。我国多项调查报道[4-5]，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性及CRKP检出率呈逐年上升趋势，CRKP感染治疗已成为当前临床感染防控工作面临的严峻考验。本研究检测分析CRKP基因类型并对患者临床特征进行分析，以期为临床防控及治疗CRKP提供参考。

资料与方法

一、临床资料

回顾性分析我院2018年9月～2021年8月收治的56例分离出CRKP菌株患者的临床资料。纳入标准：(1)根据病原学检测确诊，经血培养或痰培养，携带细菌鉴定结果为CRKP阳性；(2)临床资料完整；(3)年龄≥18岁。排除标准：(1)同一患者重复菌株；(2)可疑污染挑取血液或痰液可疑部位(脓、 黏液)涂片，革兰染色后进行显微镜检查， 根据平均每个低倍视野下出现鳞状上皮细胞(Squamous epithelial cells，SEC)和白细胞(white blood cell，WBC)的多少或比例，判断送检标本污染程度，不合格标准[6]：SEC≥10个或WBC≤25个；SEC/WBC≥1.25；SEC>0，WBC=0。本次研究符合《赫尔辛基宣言》相关要求。本次研究通过医院伦理委员会审核，符合审核标准，伦理同意号：(同)2021-019-01。

二、方法

1 CRKP耐药基因检测 使用PCR扩增和DNA测序检测CRKP耐药基因(包括KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48)，引物参考相关文献[7-8]设计，并由TaKaRa生物技术公司合成，引物序列(见表1)。

表1 CRKP耐药基因引物序列

2 细菌鉴定及耐药性分析 使用全自动微生物分析系统(Vitek 2 Compact 30，法国生物梅里埃)进行病原菌鉴定及耐药性分析，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

三、观察指标

记录患者年龄、性别、收治科室、标本来源、合并基础疾病情况、抗菌药物使用情况、住院时间以及侵入性操作情况等资料。

四、统计学方法

结 果

一、CRKP基因型分析

经检测及BLAST比对，56株CRKP中检出47株KPC型耐药基因(83.93%)、9株NDM-1型耐药基因(16.07%)，未检出IMP、VIM以及OXA-48耐药基因(见表2)。

表2 56例CRKP基因型分析

二、不同基因型CRKP耐药性分析

耐药性分析结果发现，KPC和NMD-1型耐药基因对氨曲南耐药性差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 不同基因型CRKP耐药性分析

三、不同基因型CRKP患者临床特征分析

KPC和NMD-1型耐药基因对应患者年龄、性别、收治科室、标本来源分布情况、合并基础疾病、抗菌药物使用时间、3种及以上抗菌药物联用史、住院时间以及侵入性操作比较差异均无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表4 不同基因型CRKP患者临床特征分析

讨 论

碳青霉烯类抗菌药物是临床治疗革兰氏肠杆菌属细菌感染的常用药物，然而由于该类药物频繁及不合理使用使病原菌耐药性不断增强，最终导致耐碳青霉烯肠杆菌形成，给感染防控、医疗工作带来了极大的挑战[9-10]。CRKP是耐碳青霉烯肠杆菌中最常见的一类细菌，同时也是临床感染中最重要的病原菌之一，其在全球范围内广泛传播，CRKP已成为当前临床上亟待解决的医学难题[11-12]。

本文研究结果表明，56株CRKP检出47株KPC型耐药基因和9株NDM-1型耐药基因，其检出率分别为83.93%和16.07%，提示CRKP基因型主要以KPC型为主。黄秋艳等[13]研究报道，CRKP常见类型为KPC，少见NDM-1和VIM，陈娅等[14]研究也表明，分离CRKP均检出KPC型耐药基因，均与本文研究结果相符。值得注意的是，CRKP耐药机制较为复杂，而其中产碳青霉烯酶是CRKP耐药主要原因[15-16]。碳青霉烯酶主要包括A、B、D三类，A类主要水解头霉素类以外几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物，其主要包括KPC、SME、GES等，B类包括NDM-1、IMP、VIM等，相比于A类酶检出相对较少，其对青霉素类、头孢菌素类以及碳青霉烯类药物耐药性较强，对单环β-内酰胺类抗菌药物较敏感，D类主要包括OXA-48，在我国检出率较低，其主要对苯唑西林有较强耐药性[17]。本文研究结果表明，KPC型和NDM-1型耐药基因对氨曲南耐药性有明显差异，氨曲南是临床中常用的一种单环β-内酰胺类抗菌药物，结合前文研究表明耐药性差异与基因型类型不同有关，CRKP不同基因型对于不同抗菌药物存在异质性，临床治疗CRKP患者可结合基因检测结果合理使用抗菌药物，值得注意的是，本研究中KPC和NDM-1对其他常用抗菌药物的耐药性也有所差异，但由于样本量较少，两者未见显著差异，后续还需收集更多样本进一步分析验证。

本研究进一步分析患者临床特征，结果表明，56株CRKP收治科室分别为重症监护室、肿瘤科、神经内/外科、康复科、消化内科、肾内科、泌尿外科、呼吸科、感染科、内分泌科、普外科，其中CRKP分离的临床科室在重症监护室占比最高，占28.57%(16/56)，与相关研究报道相符[18]。重症监护室患者通常病情较严重，免疫功能较弱，病房环境相对复杂，且常常需要接受气管插管、机械通气、中心静脉置管等侵入性操作，相比于其他科室患者更加容易发生感染，因此结合本文研究结果提示CRKP感染防控治疗工作需重点关注重症监护室患者情况[19]。分析CRKP菌株标本来源发现，56株CRKP菌株分别来源于痰样、尿液、血液、脓液以及其他(胆汁、引流液等)，其中CRKP菌株来自痰样标本最多，占42.86%(24/56)，其次为尿液，占26.79%(15/56)，张侃等报道[20]，CRKP分离菌株主要来源于呼吸道和泌尿道，与本文研究结果相符。既往相关研究也报道[21]，呼吸道和泌尿道是人体与外界相通的腔道，是感染发生最常见的场所，结合本文研究结果提示，CRKP感染防控需加强患者呼吸道管理和基础卫生护理工作，以尽量避免患者发生呼吸道及尿路感染。但值得注意的是，本研究结果表明，两组患者的年龄、性别、收治科室、标本来源分布情况、合并基础疾病、抗菌药物使用时间、3种及以上抗菌药物联用史、住院时间以及侵入性操作等临床特征比较差异均无统计学意义，与既往相关研究[22-23]结论有所不同，分析其原因可能与本研究采集样本量较少所致，增加样本量两组患者各指标差异是否显著化仍有待进一步研究。

综上所述，CRKP基因型主要以KPC型最常见，占83.93%，不同基因型CRKP对常用抗菌药物耐药性存在异质性，临床抗感染治疗需结合基因检测及耐药性分析制定合理方案，此外，不同基因型CRKP临床特征无明显差异，但由于样本量较少，统计分析结果可能存在片面性，研究结果可信度不高，此外，由于本研究样本均取自同一中心病例，研究结论具有一定局限性，因此还需收集更多中心的样本进行多中心研究以完善本文研究。