分析化学在药物研发中的作用

赵晓辉，刘来亮

（淄博市食品药品检验研究院，山东淄博 255000）

药品研发是一个复杂的过程，从最初的想法到推出成品可能需要12-15a的时间。目标药物的选择有多种来源，例如学术研究和临床研究等。在一项药物研发计划选择目标药物之前，需要经历多年的时间来建立一整套支持证据验证其疗效。一旦选定了目标药物，制药业和最近的一些学术中心就会简化一些早期过程，以识别具有适当特性的分子，从而生产出可接受的药物。本文主要介绍药物研发的临床前阶段，从最初的靶点识别和验证开始，论述活性药物分离、鉴定和定量分析的一般方法和考虑因素，这些分析方法可应用于药物开发的各个阶段。

1 药物研发过程

药物研发是从发现到质量、疗效和安全性表征的复杂过程，需要广泛的科学专业知识。研发机构必须充分地设定药物靶点并选出成功概率最高的化合物。从最初的发现阶段到药物可用于治疗患者，研发一种新药可能需要长达15a的时间。药物研发包括以下五个主要阶段。

1）发现或发现前阶段。首先确定一个有治疗效果的药物靶点并明确它对疾病的影响，此过程需要1~2a时间。随后，依据药物靶点筛选先导化合物，此过程需要1~2a时间。进而，提高先导化合物的效果和安全性，此过程需要1~2a时间。

2）临床前阶段。主要任务为药理学研究和药剂学研究，此过程需耗时约1a时间。药理学研究包括毒理学试验、动物实验等，药剂学研究主要是剂型的确认以及处方的筛选。

3）临床研究阶段。一期临床试验阶段主要任务是确认安全剂量，需要20~100名健康志愿者。二期临床试验阶段主要任务是分析药物的疗效并检验其短期的副作用，需要100~500名病患志愿者。三期临床试验阶段主要任务是确认药物的疗效并检验其长期的副作用，需要1 000~5 000名病患志愿者。

4）获得药物监督管理局的审批。

5）药物上市以及四期临床试验，主要任务是进一步考察药物的安全有效性。

2 分析方法在药物研发中的作用

2.1 滴定法（Titrimetric Methods）

滴定法仍被使用，特别是在欧洲药典中。这些方法的优点是省时省力，精密度高，不需要使用标准品。非水滴定法是药物分析中常用的方法，可以推广到弱酸和弱碱。在大多数情况下，用电位法检测终点，从而提高了方法的精密度。在滴定法的情况下，测定的下限和上限通常在分别为98.0%~99.0%和100.5%~102.0%（最典型为99.0%~101.0%）。近年来，滴定法已用于商品剂型中厄贝沙坦和富马酸酮替芬的测定[1]。

2.2 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）

高效液相色谱法首次用于原料药的分析是在1980年。目前，高效液相色谱法已广泛应用于药物的研究开发和制药生产中。在研究和开发中的应用包括新药合成的纯度控制、药物和制剂稳定性测试过程中产品的分离以及药代动力学，即测定在代谢和临床研究过程中生物体液中的药物和代谢产物。在医药生产中，高效液相色谱法广泛应用于原料药和最终剂型的质量控制。从各种色谱技术的使用率中可以看出，高效液相色谱是药物杂质分析的主要技术之一。选择合适的检测方式是确保检测到所有组分的关键。在紫外光检测中，可通过多波长扫描程序解决这一问题，该程序可以同时监测几个波长，并确保检测限以上的所有吸收紫外光的成分都被检测到。光电二极管阵列检测器是高效液相色谱检测对映体药物纯度的有效方法。紫外吸光度检测的反相色谱模式是常用的分析模式，能够确保最佳的可靠性、分析时间、重复性和灵敏度。由此可见，高效液相色谱在药物研发中发挥了重要作用。高效液相色谱法的局限性包括色谱柱和溶剂的成本，以及色谱柱填料缺乏长期的可重复性。

液相色谱与质谱联用技术（Liquid Chromatography- Mass Spectrome，LC-MS）已成为近30a以来最重要的技术之一，是药剂学中许多质量控制和保证阶段分析支持的首选方法。近年来，高效液相色谱-质谱已被用于药物的分析[2-3]。

2.3 气相色谱（Gas Chromatography，GC）

气相色谱法（GC）是一种分离和检测挥发性有机化合物的动态方法。气-液色谱法在制药产品的分析中起着重要作用。该技术的主要限制在于药物的相对不挥发性，例如无法应用于高分子量产品如多肽或热不稳定抗生素的检测。近年来，气相色谱已被用于药物的测定[4-5]。由于大多数药物材料的挥发性和热稳定性不足，气相色谱只能在有限的情况下用于药物检测。

2.4 毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）

“毛细管电泳”是指在电场影响下的窄孔毛细管中进行分离的一系列相关技术。毛细管电泳已迅速成为一种强大的分离有机或无机大分子和小分子的技术，并在环境、临床、法医、生化和药物分析等各个领域得到了应用。与其他技术相比，毛细管电泳具有分辨率高、样品和溶剂消耗低、检测器类型灵活多变等优点。毛细管电泳可应用于水和非水介质中，并且可以与多种检测器耦合。此外，由于毛细管电泳具有很高的效率，该技术在分离对映体方面具有出色的应用效果。

2.5 薄层色谱（Thin Layer Chromatography，TLC）

20世纪60年代薄层色谱（TLC）的发明和迅速推广开创了药物分析领域的一个全新局面。薄层色谱是筛选药物制剂中未知物质的有力工具，它具有相对较高的分离效率，即药物的所有可分离的成分都能够被分离。利用薄层色谱的高特异性，采用斑点洗脱和分光光度法进行定量分析。薄层色谱法已被应用于几种降压药（美托洛尔和非洛地平）的测定[6]。

2.6 高效薄层色谱（High Performance Thin Layer Chromatography，HPTLC）

高效薄层色谱因操作成本低、样品通量大、样品需求量少等优点，已成为一种常规的分析技术。与高效液相色谱不同，高效薄层色谱的主要优点是可以用少量流动相同时运行多个样品，从而降低了每次分析的时间和成本。高效薄层色谱已用于药物制剂中多种药物的测定[7-8]，并且HPTLC检测的杂质量限制在0.1%以内。

2.7 流动注射分析（Flow Injection Analysis，FI）

流动注射分析是一种成熟的自动化分析技术，在化学定量分析中有着广泛的应用。简而言之，典型的流动注射设置包括将一定体积的样品注入流动的溶剂流中，该溶剂流作为载体推动样品通过检测器。在注射点和检测点之间，感兴趣的分析物被化学或物理转化为可检测的目标。流动注射分析通常是一种简单和廉价的技术，采用常见的仪器，如蠕动泵和低压注入阀。与批处理方法相比，流动注射分析提供了更高的采样率，更低的试剂消耗以及更好的精度和高通用性。流动注射分析优点使其在药物分析和质量控制中的应用不断增加。流动注射分析在药物分析中的最新应用包括左氧氟沙星和驱虫药的测定[9-10]。

2.8 紫外-可见分光光度法（UV-Visible Spectrophotometry）

药典中的另一类方法是基于自然紫外-可见光吸收的分光光度法和基于化学反应的可见分光光度法。比色法通常基于以下几个方面。

（1）络合物形成反应。

（2）氧化还原过程；

（3）催化作用。这些方法的优点是节省时间和劳动成本，并且精密度也很好。比色法经常用于散状物料的分析。例如，蓝四唑法被应用于皮质酮甲状腺药物制剂的检测。

2.9 导数分光光度法（Derivative Spectrophotometry，DS）

导数分光光度法具有灵敏度高、选择性好、成本低等优点，已广泛应用于定量分析。导数光谱通常比正常的零阶导数光谱包含更多的表观光谱细节。导数分光光度法是一种非常有用的分析方法，用于分离具有重叠光谱的药物混合物。此外，还成功地应用于有降解产物存在的药物的测定，以及有药物添加剂和分解产物存在的单个药物的测定。因此，与常规分光光度法和衍生物法测定药物化合物相比，导数分光光度法可以消除单个药物测定时的干扰。

2.10 荧光法（Fluorimetry）

发光现象涉及化学物质的电磁辐射，是当前活跃的研究领域之一。荧光是一种发光现象，最常用于分析化学的各个领域，包括药物分析。荧光光谱法涉及增强或淬灭荧光信号的测量。关于荧光测量方法，有些方法涉及化学反应，而其他方法则基于被分析物的原生荧光。应用于药物分析的荧光技术提高了分析过程的灵敏度、选择性、准确性和快速性。例如，荧光法已被应用于直接测定恩诺沙星和氟哌啶醇[11]。

2.11 近红外光谱（Near-Infrared Spectroscopy）

近红外（Near-Infrared，NIR）波长区（780~2 500nm）位于可见光的红色波段和中红外波段之间。近红外信号是氢键，如C-H，N-H和O-H分子振动（泛音和基本振动的组合）导致光吸收的结果。这是一种非常快速的技术，利用最现代的仪器采用傅里叶变换（Fourier transform，FT-NIR），可以在几秒钟内记录一个光谱。这种技术最大的优点是分析的非破坏性：不需要（或只需要很少的）准备程序就可以分析样品，从而避免了产生误差样品预处理步骤。在许多情况下，这也允许样品在测量后重复使用。近红外光谱也可用于定量复杂基质中特定化合物的测定，例如药物制剂。对片剂中原料药的近红外定量分析已有文献报道和综述。在过去的十年中，描述完整片剂中原料药近红外定量测量的公开论文数量急剧增加。

2.12 核磁共振光谱法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）

核磁共振波谱法可用于原料药的鉴别、合成和降解过程中产生的物质的鉴别和定量，以及测定分析过程中残留溶剂。核磁共振信号强度I与引起信号的核数N成正比。因此，核磁共振信号的强度（定义为特定信号下的面积）可以用来进行定量分析。在单脉冲激发的情况下，信号强度I与核数N之间的线性关系由以下公式表示。

其中，比例系数CS取决于光谱仪的参数和样品性质。

核磁共振波谱技术广泛应用于药物分析中，用于药物及其伴随杂质的鉴别。核磁共振可用于药物分析，以便评估杂质水平，阐明它们的结构，确定和/或观察导致相关杂质的降解过程；评估残留溶剂的含量；用手性添加剂测定异构体组成；测定（质子化的）碱性药物和（去质子化的）有机酸在各自盐中的摩尔比。

2.13 质谱分析（Mass Spectrometry，MS）

在过去的15a里，质谱在生物医学和生物学研究特别是药物发现领域取得了显著的进展。电喷射离子化和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）技术的发展是质谱能够应用于这些领域的重要原因。目前，质谱结合各种色谱的方法是药物分析最强大的技术。质谱凭借其速度、灵敏度和高通量的优势，已经发展成为药物发现的支柱。高效液相色谱-质谱联用技术已成为药物分析中最突出和最有价值的技术之一，并已被应用于药物代谢研究、药物和代谢物的高通量分析、药物中杂质和降解产物的分析和鉴定，以及手性杂质的分析。

2.14 电化学（Electrochemical）技术

在过去的几年里，电化学技术在药物分析中的应用越来越多。人们对电化学技术重新产生兴趣，部分原因是仪器越来越精密，并且对技术本身的理解也越来越深入。电化学技术已被应用于吉米沙星、瑞舒伐他汀钙等药物的测定。

2.15 动力学方法

动力学方法是在样品和试剂手动或自动混合后，通过信号变化检测分析物的浓度随时间变化的情况。有几种方法可以用于在没有任何动力学干扰情况下的单一组分的测定。固定时间法和初始速率法已被频繁应用于药物制剂和生物体液中药物的测定。多组分动力学测定法（常称为差异速率法）在药学研究领域也越来越流行。两种新方法，即动力学波长对法（kinetic wavelength pair method）和H点标准加法（H-point standard addition method）被提出用于处理二元混合物中组分的重叠光谱。

3 结束语

新治疗药物的开发涉及多种基础学科，这些学科一直是药物发现的核心。例如利用结构生物学来提供有关目标药物的分子结构信息，设计和合成候选药物；利用药理学来确定药物与靶点之间相互作用的效果等。通过建立新方法、引入新学科以及不断改进现有的分析技术才能将药物发现提升到一个新的水平。将集成高精度的新计算方法、生物信息学、药物基因组学、工程和/或纳米技术方法整合到药物研发过程中，有希望将药物发现带入到下一个发展阶段。