奶牛小肠上皮细胞热应激模型的建立

2023-01-11张艳芳纪雯雯魏筱诗茅慧玲

家畜生态学报 2022年12期

金钊,张艳芳,周华,纪雯雯,魏筱诗,王翀,茅慧玲

(浙江农林大学动物科技学院·动物医学院，浙江杭州311300)

随着全球变暖的加剧，近10年来环境温度不断上升[1]。动物机体在严重的外界热环境刺激下自身的产热与散热失衡，从而引起非特异性应答反应，即热应激。有调查指出58%以上的奶牛生活在温湿度指数高达68以上的高温亚热带地区，造成奶牛热应激[2]。

热应激能够加剧活性氧(Reactive oxygen species，ROS)种类的生成，打破自由基和抗氧化系统的平衡，最终导致氧化应激[3-5]。且热应激状态下，奶牛胃肠道收缩以重新分配外周血液来增加机体热量的消耗，血流量减少导致肠上皮缺氧，从而损伤肠道的完整性，造成其生理功能下降，增加健康问题的风险，最终降低奶牛产奶量[6]。因此，探索减轻奶牛痛苦，减少热应激引起经济损失的有效方法具有十分重要的意义。

本试验利用奶牛小肠上皮细胞系，构建奶牛小肠上皮细胞体外热应激模型，为进一步研究奶牛肠道在热应激状态下的营养物质吸收规律提供平台和基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

试剂：DMEM培养基和磷酸缓冲盐溶液(上海生工生物工程有限公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；青链霉素和细胞冻存液(杭州昊天生物技术有限公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；活性氧试剂盒(碧云天生物)；抗氧化相关酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；CCK-8试剂盒(MCE公司)。

仪器：CO2培养箱(THermo)、倒置显微镜(Motic)、酶标仪(THermo)、T6 紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 细胞培养与试验处理

永生化奶牛小肠上皮细胞系(取自空肠段)购自上海赛齐生物工程有限公司[7]。将奶牛小肠上皮细胞培养于含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素的DMEM 培养液中，置于37 ℃、5% CO2的无菌培养箱中培养。取对数生长期的细胞用于试验。

试验采用单因素完全随机试验设计，43 ℃处理奶牛小肠细胞0、2、4、8、12 h，其中0 h即为对照组(37 ℃)，测定细胞存活率及细胞活性氧含量，初步筛选适宜的作用时间。在筛选出适宜43 ℃作用时间的基础上，再测定抗氧化指标，进一步确定建立奶牛小肠上皮细胞热应激模型的条件。每组设3个重复，每个试验重复3次。

1.3 细胞存活率检测

取对数生长期的奶牛小肠上皮细胞以1×105个/mL的细胞密度接种于96 孔板上，每孔100 μL，经43 ℃分别处理0、2、4、8、12 h后，将试验孔更换为等体积新鲜培养液，加入10 μLCCK-8溶液，放回培养箱内孵育2 h。用酶标仪测定试验孔在450 nm波长下的吸光度。

细胞存活率% =(处理孔OD-空白OD)/(对照孔OD-空白OD)×100

1.4 细胞活性氧测定

细胞经43 ℃分别处理0、2、4、8、12 h后，收集各孔细胞，超声波破碎得到待测样品。按照试剂盒说明书利用荧光探针DCFH-DA测定细胞ROS含量，数据以荧光值相对于0 h的倍数表示。

1.5 细胞抗氧化酶活性测定

细胞经热应激(43 ℃)处理4 h后，收集各孔细胞，超声波破碎得到待测样品。按照试剂盒说明书分别测定总超氧化物歧化酶(total superoxid dismutase, T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(copper and zinc superoxide dismutase, CuZn-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde, MDA)。其中T-SOD活性采用WST-1法测定，单位定义为每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)，比色波长为450 nm；CuZn-SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，动物细胞内有2种SOD，即CuZn-SOD和Mn-SOD，二者相加等于T-SOD，样本经前处理后Mn-SOD活力丧失，但CuZn-SOD活力不变，比色波长为550 nm；GSH-Px活性采用比色法测定，单位定义为每0.1 mL反应液在37 ℃反应5 min，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为1个酶活力单位，比色波长为412 nm；MDA采用硫代巴比妥酸法测定，比色波长为532 nm。

1.6 数据分析

试验数据采用Excel软件进行整理后用SAS 8.0统计软件中的ANOVA进行单因素方差分析，其中热应激处理时间选择的数据用Duncan氏方差分析进行多重比较，试验结果P<0.05表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 细胞存活率及活性氧含量

由表1可见，随着作用时间的延长，细胞存活率显著降低(P<0.05)。2 h组存活率76.1%，接近80%，细胞损伤较小；4 h组细胞存活率显著降低至62.6%，符合建立热应激模型的条件；8 h和12 h组存活率进一步降低。

表1 热应激时间对奶牛小肠细胞存活率及活性氧含量的影响Table 1 Effects of heat stress on the cell viability andreactive oxygen species of cow intestinal epithelial cells

细胞内ROS含量也随着热应激时间的延长显著上升(P<0.05)。

2.2 热应激对奶牛小肠上皮细胞形态的影响

由图1可见，对照组(37 ℃)细胞贴壁良好，形态正常且分布均匀；而热应激处理组(43 ℃)细胞间隙变大并出现脱落，且随着处理时间的增长，细胞死亡数增加，尤其在12 h处理组，细胞呈现大片的死亡。

图1 热应激时间对奶牛小肠上皮细胞形态的影响(×100)Fig. 1 Effects of heat stress on the morphology of cow intestinal epithelial cells(×100)

2.3 热应激对奶牛小肠上皮细胞抗氧化相关酶活性的影响

由表2可见，与对照组(37 ℃)相比，热应激组(43 ℃)总超氧化物歧化酶活、铜锌合超氧化物歧化酶活和谷胱甘肽过氧化物酶活显著降低(P<0.05)，丙二醛含量显著增加(P<0.05)。

表2 热应激对奶牛小肠上皮细胞抗氧化相关酶活性的影响Table 2 Effects of heat stress on the anti-oxidative enzyme activities U/mg prot

3 讨论

小肠是动物体内营养物质消化吸收的主要器官，同时也是机体重要的防御屏障之一。当动物处于热应激时，机体动用全身血液以维持自身的散热功能，此时肠道便会因缺血缺氧而受到严重损伤[8]。小肠上皮细胞是一类更新速度很快的细胞，目前，在细胞水平研究奶牛热应激的报道主要集中在乳腺[9-10]，对奶牛小肠上皮的研究较少。因此，建立奶牛小肠上皮细胞热应激模型，对于揭示热应激状态下，营养物质的吸收代谢机制，研究开发缓解热应激营养添加剂等有着重要意义。

本研究前期设定3个温度(41 ℃，42 ℃及43 ℃)下分别处理奶牛小肠上皮细胞1 h，2 h及 3h，以摸索热应激的适宜温度，结果发现仅在43 ℃处理下细胞存活率有影响，因此选择43 ℃作为热应激的处理温度(数据未发表)。在热应激43 ℃处理下，细胞存活率与处理时间呈反比，处理时间越长，细胞存活率越低。细胞存活率过高说明外界刺激条件不显著，相反，存活率过低则说明细胞产生不可逆损伤。因此，选择一个合适的细胞存活率作为建模参数至关重要。孔令联等[7]认为，不同细胞建立氧化应激模型呈现的条件因细胞本身的耐受力不同而各异，选用细胞存活率的范围在50%～70%为宜。细胞内ROS的产生与清除一旦发生失衡，过多的ROS使得机体自身的抗氧化系统处于过载状态，破坏脂肪，蛋白质及DNA的正常代谢，扰乱正常细胞的功能从而诱发细胞凋亡[11-12]。ROS的产生在热应激诱导的细胞凋亡中起重要作用[13]。本研究选择的热应激处理时间为4 h，该条件下细胞的存活率为62.6%且ROS产量与对照组相比显著上升，说明细胞发生了损伤且细胞存活率在建模适宜范围之内，符合建模条件。

正常状态下，动物机体内氧化系统与抗氧化系统处于一个动态平衡状态，代谢过程中产生的自由基能被体内的抗氧化酶及时清除。而当外界环境发生变化，如断奶，热应激等，机体的这种动态平衡便被打破，自由基不能被及时清除，从而产生氧化应激[14]。机体内，SOD是对抗自由基的第一道防线，GSH-Px可以清除超氧阴离子自由基，二者是机体抗过氧化能力的重要指标，对机体的氧化与抗氧化平衡起关键作用[15]。另一方面，自由基过量产生导致脂质过氧化，脂质过氧化的终产物MDA含量显著增加[16]，最终造成细胞损伤[17]。本试验中，热应激处理细胞4 h后，抗氧化酶SOD，CuZn-SOD和GSH-Px的活性显著下降，导致细胞抗氧化防御能力下降，且MDA的含量显著增加，说明细胞的氧化-抗氧化平衡系统被打破，发生了氧化应激。Wang等[12]研究报道奶牛卵巢颗粒细胞在40 ℃处理后显著降低SOD和GSH-Px的酶活性，增加MDA的含量。Li等[18]研究发现，西门塔尔和秦川杂交牛的空肠上皮细胞经43 ℃处理2 h后SOD、GSH-Px酶活力显著降低，MDA含量显著增加。这些结果均说明细胞在热应激状态下会发生氧化应激，而热应激处理的温度不同可能与研究的细胞不同有关，不同物种的不同细胞对温度的耐受程度存在较大差异。