外周血Th9、Th22和Treg细胞及细胞因子在过敏性鼻炎中的研究

李 志,杨婷婷,李文哲,王 波,薛邦禄

(1.大连市中心医院 检验科,辽宁 大连116033;2.大连医科大学基础医学院,辽宁 大连116044)

过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又称变应性鼻炎,是指某种变应原接触某些个体后,引起机体的免疫系统过度反应,进而对人体的气道有不同程度损伤的非感染性炎性疾病。随着空气污染因社会发展而加重,加之全球气候变化、人口增多、人员流动性增大,过敏性疾病的患病率逐年升高,造成人们的工作效率严重下降、生活状态受到影响。2017年的调查研究发现,世界范围内10%-40%的人口正在经受过敏性鼻炎的困扰[1],AR在近几年逐渐成为引起人们注意的一个重要疾病。近年来,许多的研究发现,在过敏性疾病中,T淋巴细胞发挥不容忽视的作用,其中CD4+T淋巴细胞的变化最为明显。在过敏性鼻炎中,Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)、Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)数量和功能的变化,以及主要细胞因子如伽马干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等维持着机体内抑炎、促炎平衡。然而,随着研究的逐步深入,发现Th9细胞、Th22细胞和Treg细胞等多种细胞及其主要细胞因子-白细胞介素-9(IL-9)、IL-22及转化生长因子-β(TGF-β)对过敏性疾病的发生、发展发挥重要作用。本次实验通过对AR患者外周静脉血中Th9、Th22和Treg细胞的百分比,以及主要细胞因子与IgE的检测与分析,探究AR患者Th9、Th22细胞和Treg细胞和细胞因子作用及其分泌异常的临床意义。

1 材料与方法

1.1 样本来源

选取2019年4月至2019年10月入大连市中心医院确诊的过敏性鼻炎患者48例。过敏性鼻炎的诊断标准参考中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2016年1月第51卷第1期《变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015,天津)》[2]。AR患者组共48例,其中男26例,女22例,年龄范围(19-63)岁,平均年龄32.6岁(过敏性鼻炎患者样本收集前1个月并未使用相关药物进行治疗)。对照组为40名体检正常人,其中男21例,女19例,年龄范围(20-57)岁,平均年龄35.9岁。健康对照组和AR患者组在性别、年龄方面均没有统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要实验仪器及试剂

1.2.1主要实验仪器 流式细胞仪为Epics-xl型,来自美国贝克曼公司。酶标仪为Sunrise酶标仪,来自奥地利Tecan公司。特定蛋白分析仪为IMMAGE 800,采购自美国Beckman公司。此外,实验还用到离心机、冰箱、37摄氏度的5%二氧化碳培养箱等。

1.3 标本采集

采集过敏性鼻炎患者组和健康对照组的空腹静脉血各3-4 ml留存于肝素抗凝管和促凝管中,标本无溶血和乳糜。

1.4 标本预处理

1.4.1收集外周血单个核细胞(PBMCs) 取无菌离心管一支,向其中加入2 ml的淋巴细胞分离液。然后取相同量的磷酸盐缓冲液将静脉抗凝全血1∶1稀释,将稀释后的全血慢慢地加入分离液离心管中,2000 r/min离心20 min,将单个核细胞用毛细吸管取出,放入另一支无菌离心管中待用。

1.4.2分离血清 待促凝采血管中的血液凝固,离心后取出血清并分为两份：一份使用特定蛋白仪测定血清中总IgE的水平;另外一份置于-70℃冰箱冷冻保存,用于ELISA检测细胞因子IL-9、IL-22和TGF-β的表达水平。

1.5 实验方法

1.5.2Treg细胞的染色 取两支试管分别加入实验组和对照组抗凝全血各200 μl,每管加入20 μl APC标记的抗人CD4和PC5标记的抗人CD25单抗,混匀,于避光处孵育20 min。每管中加入2 ml溶血素溶解红细胞,PBS缓冲液洗涤两次后加入Foxp3 Fix/perm Buffer对细胞进行固定和破膜,洗涤细胞后加入PE标记-抗人Foxp3单克隆抗体和同型对照10 μl,避光条件下孵育30 min,洗涤两次后加入PBS缓冲液重悬细胞,上机检测。

1.5.3流式细胞仪检测Th9、Th22、Treg细胞 将染色后的Th9、Th22及Treg细胞放入Epics-xl型(Beckman coulter)流式细胞仪进行检测。本实验中,认为CD4+IL-9+为Th9细胞,CD4+IL-22+为Th22细胞,CD4+CD25+Foxp3+为Treg细胞。

1.5.4测定IL-9、IL-22及TGF-β在血清中的表达水平 本实验使用ELISA试剂盒测定血清中IL-9、IL-22及TGF-β的浓度,严格遵照说明书的指示进行操作。

1.5.5检测血清中总IgE的含量 特定蛋白分析仪IMMAGE 800使用前已经进行内部冲洗、原装配套试剂装载和定标,将标本预处理中分离所得血清放入仪器中进行检测并获得有关数据。

1.6 数据分析

2 结果

2.1 Th9、Th22、Treg细胞的比例

同健康对照组相比,过敏性鼻炎患者外周血Th9细胞占PBMCs的比例明显增高,差异有统计学意义(P<0.0001),Treg细胞所占比例明显下降,差异有统计学意义(P<0.0001),而Th22细胞的比例与健康对照组相比无显著性差异(P=0.64),见表1。

表1 两组Th9、Th22和Treg细胞在PBMCs中所占比例

2.2 IL-9、IL-22、TGF-β及总IgE的表达水平

AR患者血清中 IL-9 和 IL-22细胞因子的水平相比对照组增高,差异均有统计学意义(P<0.0001),AR患者血清中 TGF-β细胞因子的水平相比对照组降低,差异有统计学意义(P<0.0001),见表2。

表2 两组TGF-β、IL-9和总IgE在血清中的含量

2.3 IL-9、TGF-β与总IgE的关系

IL-9与总IgE的含量在AR患者的外周血血清中呈正相关(r=0.488,P<0.05),TGF-β与总IgE的表达水平呈负相关(r=-0.679,P<0.05),见图1和图2。

图1 AR患者血清中IL-9与总IgE含量呈正相关

图2 AR患者血清中TGF-β与总IgE含量呈负相关

3 讨论

过敏性鼻炎的发生与机体的过度免疫应答息息相关,疾病的发生由IgE介导,伴有多种免疫活性细胞和细胞因子等成分参与其中[3]。在生活和工作中,如房间内灰尘、花粉、柳絮之类的变应原吸入机体后与人体IgE分子 Fab端结合,鼻黏膜处于致敏状态[4]。当机体再次遇到同一种物质时,CD4+T淋巴细胞经刺激后分泌的细胞介质会与鼻粘膜血管、腺体和神经末梢上的受体结合[5],从而引起鼻粘膜血管收缩、毛细血管通透性增加、嗜酸性粒细胞浸润组织[6],兴奋副交感神经,进而引发打喷嚏、流鼻涕等临床症状。本实验中,与健康对照组相比,总IgE的表达水平在AR患者的血清中明显升高,提示机体处于过敏状态。除了免疫球蛋白参与到过敏性鼻炎中,T淋巴细胞的功能也不容小觑。在过去的一段时间中,很多研究人员认为过敏性鼻炎的发生是与Th1、Th2两者细胞的比例以及相关的一系列细胞因子有关系,在正常情况下,Th1、Th2类细胞二者的比例是属于相对稳定的情况,以保持体内细胞免疫的正常工作;当机体处于过敏状态时,T辅助细胞向Th2方向偏移,从而引起Th2细胞亚群数量增多、功能增强,以及相关细胞因子优势表达,机体因此受到损伤[7]。然而,随着研究的逐步深入,Th9、Th17、Th22、Treg细胞等T淋巴细胞亚群相继被发现,丰富了原先的理论,它们的作用也逐渐被重视起来。在本次实验中,我们着重研究Th9、Th22、Treg在过敏性鼻炎中的意义。

2008年,通过PCR和胞内染色的方法,研究人员Dardalhon和Veldhoen等于小鼠模型中发现,IL-4和TGF-β都存在时,初始CD4+T淋巴细胞可分化成一种会分泌大量的IL-9的细胞,并将其命名为Th9细胞[8]。在Th9细胞的分化调控中,2010年Chang HC等人的研究中发现,Th9细胞转录分化的过程中,PU.1(ETS转录因子家族成员之一)被证明是其特征性因子[9],还有干扰素调节因子4(IRF4)也在Th9细胞诱导分化中起着重要作用[10]。此外,编码细胞因子IL-9的基因Il9的转录量、T细胞受体活化、共刺激分子(如肿瘤坏死因子样配体1A、OX40)、其他细胞因子(如白介素-4、白介素-2、TGF-β、白介素-25、白介素-33、IFN-γ)等也调控Th9的分化。对于过敏性疾病,Th9细胞的主要细胞因子IL-9起两种作用,一是刺激上皮细胞表达嗜酸性粒细胞和T细胞趋化因子使免疫细胞聚集,激活T细胞和肥大细胞发挥作用;二是显著刺激B细胞增殖分化和IgE的表达水平升高,二者可共同加重过敏炎症。在Zhao Wei Gu等人的研究中发现,过敏性鼻炎的小鼠模型中Th9细胞的比例高于对照组,IL-9的含量明显高于对照组,而IL-9中和抗体的治疗会减轻小鼠的过敏症状[11]。Ciprandi G等人发现,随着AR患者临床症状愈发加重,血清中IL-9的表达量进而升高,反之亦然[12]。在本实验中,AR患者Th9细胞的比例明显升高;血清中IL-9水平也升高,并与血清总IgE呈正相关,提示Th9细胞及其主要细胞因子的变化与过敏性鼻炎密切相关,抗IL-9治疗可为临床AR治疗提供一个新的靶点。

Th22 细胞是一种独立于 Th1、Th2 和 Th17 细胞且主要分泌 IL-22 的新型 CD4+T 细胞,其配体依赖转录因子 AHR 可与炎症介质可通过影响 CD4+T 细胞进而调节 IL-22 的表达。IL-22 有极其复杂的生物学作用,它既有抗炎活性,但在某些情况下也有放大炎症反应的作用[13]。支气管哮喘和变应性鼻炎均属于过敏性疾病,目前支气管哮喘的研究表明Th22 及其相关细胞因子分泌增高,但对于IL-22 在哮喘中对炎症的促进或抑制作用还存在争议。Th22 细胞及其细胞因子在变应性鼻炎中的研究还未见报道,本研究发现在 AR 中 Th22 细胞比例与健康组相比无明显变化,而 IL-22 细胞因子在变应性鼻炎患者体内表达增加,其原因可能是Th22细胞本身在机体内数量极少,多数患者发病周期短且症状较轻,当鼻粘膜发生过敏性病变产生局部性炎症时,在全身血液循环作用下外周血中 Th22 可能会降低,导致 AR 患者Th22 与对照组相比无显著差异。IL-22表达升高是因为IL-22 既可由 Th22 分泌,也可由 Th1、Th17、自然杀伤细胞(NK)、γδT 细胞、中性粒细胞等共同产生,因此 IL-22 在 AR 患者体内的增加不足以证明 Th22 在变应性鼻炎的免疫发病机制中发挥作用,因此还需进一步的研究证明。

1995年,坂口等人发现Treg细胞可以抑制免疫反应[14],它分泌的主要细胞因子是TGF-β和IL-10,表达特征性转录因子Foxp3,进而调节Treg细胞作用的强弱和关键功能。在人类个体中,机体的正免疫应答被Treg细胞的细胞因子和细胞-细胞接触反应所影响,进而表现为免疫耐受[15]。近期的研究表明,Treg细胞占CD4+T细胞比例的多少随着过敏性鼻炎的严重程度而变化[16],TGF-β能够参与Foxp3的表达,维持Treg细胞的数量和其免疫抑制的功能。本次研究发现,Treg 细胞比例及 TGF-β 细胞因子在变应性鼻炎患者体内表达减少,并且AR患者外周血血清中TGF-β的含量与IgE呈负相关。因此认为Treg 细胞通过其分泌的细胞因子TGF-β发挥作用,Treg 细胞数量减少可能引起其抑制作用减弱,从而促进 AR 的发生。由此可以看出,AR的发生与维持机体免疫稳态的Treg细胞在患者体内失衡有关。

综上所述,AR 患者外周血中 Th9、Treg 细胞及其相应细胞因子分泌异常、比例失调在AR的发病过程中起着重要作用,其相关细胞因子 IL-9和 TGF-β 的检测可为病情判断提供重要参考指标,也可为临床病因的分析指导和疾病的早期诊断提供理论依据。抗IL-9治疗或许可为今后进一步研究AR患者抗过敏治疗提供新的方向。Th22 细胞在 AR 中的作用则还需进一步研究。

4 结论

本研究发现过敏性鼻炎患者外周血Th9细胞的百分比及细胞因子IL-9、IL-22和总IgE表达水平显著升高,Treg细胞的百分比和TGF-β浓度显著降低,并且IL-9与总IgE水平呈正相关,TGF-β与总IgE水平呈负相关。以上结论说明患者外周血Th9、Treg细胞及细胞因子的分泌异常、比例失调在过敏性鼻炎的发病过程中起着重要作用,可作为病情诊断的重要参考指标,也可为临床病因的分析研究提供理论依据,抗IL-9治疗或许可为今后进一步研究AR患者抗过敏治疗提供新的方向。而 Th22 细胞目前不明确,可能没有参与 AR 的发病机制。