脑脊液ctDNA及其他生物标志物在原发中枢神经系统淋巴瘤中的研究进展

蒋皓云，金祺祺综述 吴重阳审校

作为一种肿瘤来源的碎片化游离 DNA，循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)在外周血中富集，并可反映整个肿瘤基因组的信息。其检测方法从PCR技术到NGS和ddPCR技术的转变，使得ctDNA 定量检测的准确性得到明显提高。通过监测实体肿瘤血浆ctDNA来构建的基因图谱，不仅弥补了组织评估肿瘤相关基因改变的不足，并已被证明在实体肿瘤早期识别与诊断、肿瘤分子异质性评估、靶向治疗的遗传决定因素的鉴定、肿瘤动力学监测、早期治疗反应评估和微小残留监测、肿瘤耐药性演变的及时评估、疾病进展监测等方面具有广泛潜力。尽管目前血浆ctDNA不是系统性弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)的常规监测指标，但是血浆ctDNA在系统性DLBCL的治疗前、治疗中及治疗后均有不少探究。已有报道发现，中枢神经系统肿瘤的脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中，富含表征肿瘤特征的多种生物标志物。本文就CSF中ctDNA及其他潜在生物标志物在PCNSL中的研究进展进行综述，为这种微创性检测方式在PCNSL患者中的合理、规范应用提供参考,以期进一步提高PCNSL患者的诊断、疗效监测及预后判断。

1 原发中枢神经系统淋巴瘤

原发中枢神经系统淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma, PCNSL)被定义为仅累及脑、脊髓、软脑膜及眼的结外非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)，占所有原发性中枢神经系统(central nervous system,CNS)肿瘤的2%，其发病率为0.5/10万，约90%以上的PCNSL在组织学上被归类为DLBCL[1]，与系统性DLBCL比较，PCNSL 表现出更具侵袭性的生长模式，并且预后较差，5年和10年生存率分别为29.9%和22.2%[2]。原发性玻璃体视网膜淋巴瘤(primary vitreoretinal lymphoma,PVRL)是PCNSL的一个特殊亚型，年发病率为0.46/10万[3]，PVRL肿瘤最初仅出现在眼内，病变早期可在玻璃体和视网膜内查找到淋巴瘤细胞，随着疾病进展可累及到颅内，PVRL患者中脑部受累者可高达80%[3]。

PCNSL的临床表现主要与病灶累及的部位呈多灶性相关，其常见症状包括认知功能障碍、人格改变、精神运动减慢和定向障碍[4-5]。MR是目前首选的影像学筛查手段，其诊断金标准仍然是立体定向活检术，并行组织病理学和免疫组织化学染色，然而立体定向活检的不足包括：(1)具有创伤性，据报道出血率约4%，病理学诊断阴性率为8%～9%[6]；(2)大约 1% 的脑活检手术存在严重的并发症，包括血肿、癫痫发作和脑水肿及活检相关死亡[6]；(3)在某些情况下，由于肿瘤位置较深(脑干)或病灶较小，活检难度大；(4)临床中通常使用类固醇来控制PCNSL患者症状，而皮质醇可能导致肿瘤体积短期内缩小，甚至消失，降低立体定位活检的成功率。因此，对于临床上高度怀疑PCNSL，但又不适合行立体定向活检的高危患者，迫切需要一种非侵入性的检测及预测手段来弥补立体定向活检术的不足，以辅助PCNSL患者的诊断，同时结合CSF的微创检查，提高患者的疗效监测及预后判断。

2 ctDNA概述

循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 指由肿瘤细胞产生并释放到外周血液循环(或脑脊液、尿液、腹腔液、唾液、胃液等)的游离DNA，携带包括基因点突变、拷贝数异常、染色体异常等多种肿瘤遗传信息[7]，克服肿瘤的时间、空间异质性。检测ctDNA 技术的能力与肿瘤负荷相关，传统PCR、ddPCR通过靶向检测多种等位基因，提高了分析敏感度[8-9]；NGS非靶向识别拷贝数异常、单核苷酸取代和结构重排，不断改进的NGS技术，例如Safe-SeqS、CAPP-seq等大大提高了ctDNA检测的准确度和敏感度[10-11]；还有针对特定的基因点突变的实时PCR[12]、用于结直肠癌筛查的Epiprocolon-Septin9甲基化检测[13]等多种检测方法。用于评估具有 EGFR 抗性或 EGFR 致敏突变的ctDNA 检测已经进入临床实践，被指南推荐指导非小细胞肺癌治疗[14-15]。不少研究通过定性和定量分析肿瘤患者血液、脑脊液、尿液等体液中ctDNA，强调了其作为指导肿瘤临床决策(包括辅助诊断、预后预测、疗效评估、疾病监测等)的生物标志物的潜力[16-21]。

液体活检(liquid biopsy)是指利用血浆、尿液、唾液、CSF等体液中的生物标志物来分析肿瘤的技术，因其微创、可重复检测性在实体肿瘤及淋巴瘤中受到广泛关注。目前常用的可用于液体活检的生物标志物有循环肿瘤细胞、ctDNA和外泌体等。而ctDNA检测因其可实时反映肿瘤负荷及基因组信息，因此常被认为是反映肿瘤特性的可靠指标。约90%以上的PCNSL病理类型为DLBCL，血浆ctDNA的价值在系统性DLBCL患者治疗前、治疗中、治疗完成后已有探究，持续动态监测治疗前后及治疗期间 ctDNA的变化，可以提供患者肿瘤分子遗传学的整体情况，这种遗传演变包括治疗过程中突变谱的动态变化，以及因选择某种靶向治疗而出现的异质性[22-26]。这种在分子水平上对靶向药物获得性耐药机制的理解可用于规划药物治疗组合，以抑制导致治疗失败的克隆扩增，从而延缓疾病进展或复发。在血浆ctDNA的应用中，已被证实主要有以下2个因素影响其检测敏感度：(1)ctDNA的浓度：ctDNA通常需要在大量脱落的正常 DNA 中检测出肿瘤 DNA，包括肿瘤代谢体积、淋巴瘤恶性程度和肿瘤负荷等多种因素会影响ctDNA浓度[27-28]；(2)ctDNA检测方法：如上所述，不同的检测技术使得ctDNA检测的准确度和敏感度提升。

3 ctDNA及其他生物标志物与PCNSL

3.1 脑脊液ctDNA 已有研究发现，原发于中枢神经系统(包括位于脑实质、深部脑组织及脊髓)的肿瘤，其肿瘤细胞可将DNA脱落于CSF中，分析经纯化CSF 中的 DNA 可获得肿瘤的特异性突变。另外，部分初诊的PVRL患者若有CNS侵犯，CSF中也有可能检测到ctDNA。PCNSL的发生与多种分子信号改变有关，多种基因异常表达最终导致B细胞增殖、分化失控及凋亡受损。目前已经描述的各种PCNSL 的发病机制，包括 NF-κB、JAK/STAT、TLR和 BCR信号通路的失调。并且涉及到的常见突变基因包括MYD88、CD79b、CARD11等，具体描述如下。

研究发现，40%～80%PCNSL患者的NF-κB 通路基因(如MYD88、CD79b)发生改变，NF-κB是BCR信号转导的下游通路。约58%的PCNSL患者可检测到MYD88突变[29-30]，c.794T>C(L265P)的单个碱基取代导致氨基酸从亮氨酸变为脯氨酸，p.L265P氨基酸取代是 CNS 淋巴瘤中最常见的 MYD88突变[31]。MYD88 L265P取代在非血液系统CNS肿瘤的组织中几乎未被检测到[32]，Ferreri等[33]发现 CSF中MYD88 L265P突变状态区分新诊断PCNSL与其他CNS疾病的敏感度和特异度分别为72%和99%，这表明该突变是PCNSL鉴别诊断的敏感、特异标志物；此外，MYD88 L265P 对玻璃体视网膜淋巴瘤的诊断有100%的特异度[34]。陈锟等[35]报道CSF中MYD88 L265P突变与PCNSL患者的短无进展生存时间(PFS)相关，是提示预后不良的因素。另外，已有研究报道了CSF中ctDNA 的消除与PCNSL 患者的持续治疗反应相关[36]。这使得MYD88 L265P突变成为目前唯一在液体活检分析中明显可行的分子标记。

CD79b是BCR近端衔接子，BCR能引发细胞内相关信号生成的关键是免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，ITAM是含CD79a和CD79b的BCR复合体中高度保守的多肽。8%～23% 的系统性DLBCL中存在CD79b突变，且多见于ABC亚型[29，37]。据报道CD79b的突变频率在PCNSL中高达 83%[38]，明显高于系统性DLBCL；此外，CD79b和MYD88基因在PCNSL中经常发生共突变[39]，这可作为PCNSL的分子特征。CD79b突变对于PCNSL的预后影响仍存在争议[29,40]，但相关研究均是基于组织样本进行突变基因检测。此外，对于其动态监测在PCNSL病程中的意义仍需进一步探究。到目前为止，几乎没有发现CSF中CD79b突变在PCNSL的相关分析。

CARD11是一种支架蛋白，位于BCR信号通路上，介导获得性免疫。CARD11突变是ABC亚型系统性DLBCL的常见突变，与NF-κB的持续激活相关[41]，据报道CARD11突变及其蛋白过表达(免疫组化)与系统性DLBCL的不良预后相关[42]。CARD11在PCNSL的突变频率不等(18%～30%)[38]，但是目前尚未报道 CARD11 监测在PCNSL预后方面的附加价值，其在液体活检中的意义也有待探索。因CARD11位于BCR信号通路下游，其研究的一个前景在于预测药物反应，MYD88突变联合监测CARD11突变判断PCNSL患者对布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase，BTK)抑制剂的反应性可作为其应用方向之一[43]。

在有关PCNSL基因突变谱的研究中，还有影响其他通路的基因如MYC、EVT6、PIM1、TOX等。MYC是一种原癌基因，其蛋白是一种多功能转录因子，可调节涉及多种生物过程的许多基因，包括细胞生长分化、增殖和凋亡，既往研究表明，MYC信号可以使肿瘤微环境失调并逃避宿主免疫反应[44]。尹文娟等[45]发现MYC基因拷贝数增加为不良预后因素，在Gomes Candido Reis等[46]的报告中，MYC基因表达和蛋白质表达之间存在中度相关性(kappa 0.41～0.60)，且MYC过表达与PCNSL患者不良预后相关。陈红[47]研究结果也发现MYC蛋白表达≥40%是PCNSL患者的独立预后因素。

EVT6是一种转录抑制因子，在造血及细胞恶变中起作用，6%～21%的PCNSL患者发生了EVT6突变；PIM1是体细胞超突变靶点，多项研究报道了其在PCNSL的突变频率从3%～71%不等[48]。TOX基因在B细胞分化和T细胞发育中起作用，大多数研究报道了该基因的纯合缺失，在PCNSL中的频率范围为3%～30%[49]。到目前为止，还没有针对上述基因的靶向治疗，它们在液体活检中的作用尚待进一步探究。

PCNSL发病率较低，但疗效差且易复发，目前该疾病缺少显著有效的治疗方案，但随着新型检测技术的出现及对PCNSL病理生理学的深入了解，针对上述基因靶点的检测，新的靶向药物及联合治疗方案不断涌现。另外，疗程中动态监测基因突变负荷及克隆演变，有助于早期识别复发；同时，这种在分子水平上对靶向药物获得性耐药机制的理解可用于规划药物治疗组合，及时调整治疗方案延缓疾病复发或进展，有助于改善患者预后。

3.2 其他生物标志物

3.2.1 miRNA：微小核糖核酸(microRNA, miRNA) 是相对较小的非编码 RNA，长度为 18～24 个核苷酸，通过与靶标 mRNA 结合来抑制转录后基因表达，从而触发降解或翻译下调，参与细胞增殖、分化、代谢、凋亡和肿瘤发生等多种生物学过程。有研究表明，miR-125a、miR-125b、miR-17-92 簇(包括miR19b 和 miR-92a)和 miR-155在系统性DLBCL的发病机制中有显著的影响[50]。Baraniskin等[51]发现，与其他CNS疾病患者相比，PCNSL患者CSF中miR-15b、miR-19b、miR-21、miR-92a、miR-106b 和 miR-204浓度升高；且CSF中miR-21升高的患者，miR-19b 和 miR-92a 也同时升高。所以，将上述3种miRNA联合，诊断PCNSL的特异度和敏感度分别为96.7%、95.7%。CSF中miRNA 的浓度与治疗和随访期间的 PCNSL 疾病状态显著相关，证明它有作为治疗监测和随访生物标志物的能力[52]。这些数据表明，CSF中 miRNA 有可能用作 PCNSL 的非侵入性诊断生物标志物。另外，CSF中miRNA与其他潜在生物标志物(MYD88、白介素10等)联合，可进一步提高诊断的敏感度及特异度。随着时间和检测手段的改进，CSF中miRNA在PCNSL微创诊断的临床应用价值可能会得以实现。

3.2.2 IL-10和IL-6：研究发现，白介素 10 (interleukin 10,IL-10) 及其受体在PCNSL中过度表达，IL-10作为一种参与炎性反应和免疫抑制的细胞因子，在淋巴瘤的发生和发展中发挥不同的作用，并且可调节细胞的生长和分化。IL-6是一种多效性细胞因子，促进淋巴细胞的生长并调节免疫功能[53]。Nguyen-Them等[54]发现，PCNSL患者CSF中IL-10 和IL-6 水平明显高于其他CNS肿瘤。依据CSF中IL-10水平设取不同截断值，可发现其诊断敏感度及特异度不同，敏感度为65.4%～94.7%、特异度为88.9%～100%。Song等[55]分析了22例PCNSL患者的CSF样本，将IL-10临界值设定为8.2 ng/L 时，诊断敏感度和特异度分别为95.5% 和 96.1%；同时，将CSF中IL-10/IL-6 比值取0.72时，可将敏感度提高到95.5%，特异度提高到100.0%。赵晖等[56]发现IL-10的临界值选择8.47时,诊断敏感度和特异度分别为48.9%、95.6%,IL-10/IL-6的临界值选择1.38时,诊断敏感度可提升至73.3%,特异度为64.8%。CSF中IL-10、IL-6可能成为PCNSL诊断的有效指标，但是有效的截断值尚待统一。此外，脑脊液IL-10的变化与病程相关，并且可早于影像学预测复发或进展[57]。由于血脑屏障，相较于血清IL-10、IL-6检测，CSF中IL-10、IL-6水平的变化更能反映肿瘤状态，CSF中IL-10、IL-6或许可成为预后预测和动态监测的微创指标。

4 小 结

总之，对于临床上高度怀疑PCNSL，但不适合行立体定向活检的患者，及早进行CSF中ctDNA检测，同时联合其他生物标志物(IL-10、IL-10/IL-6、miRNA)，能够提高诊断的精确度，以免治疗延误。同时，对于临床上已经确诊的患者，通过动态监测CSF中ctDNA的变化，可及时、及早帮助临床指导治疗、进行疗效监测及早期预测复发等。然而，CSF中ctDNA检测仍然存在诸如有效临界值的设定、作出临床决定的最佳时间点等争议，因此临床中心之间的合作、检测精确性的提高及更多创新性临床试验的开展，将是提高液体活检技术在PCNSL临床效用的关键。