雪莲果植物乳杆菌发酵饮料的研制

王紫琳，方 冉，赵存朝，2，杨 敏，陶 亮，2*，田 洋，2，3

（1.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.国家辣木加工技术研发专业中心，云南 昆明 650201；3.食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201）

雪莲果（Smallanthus sonchifolius），学名亚贡（yacon），为菊科向日葵属双子叶草本植物，原产于南美洲西部的安第斯山脉[1]。雪莲果肉质晶莹如玉，口感甜脆，低聚果糖的含量极高，具有“低聚果糖之王”的美称[2]。雪莲果汁液丰富，适宜作为饮料、果汁等产品原料，其含有多种人体所需的营养成分，具有抗氧化[3]、调节胃肠道功能[4]、降血糖[5]、降血脂[6]等功效，具有极高的开发利用价值。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是革兰氏阳性菌的一种，属于乳杆菌科（Lactobacillaceae）中的乳杆菌属（Lactobacillus），具有较高的蛋白酶活，能分解多种大分子蛋白质和碳水化合物，产生小分子多肽及低聚糖类，提高其营养价值，促进营养物质的吸收[7]。植物乳杆菌及其代谢产物对促进人体健康具有一定作用，如平衡肠道菌群，预防和治疗肠易激综合征[8]、缓解感冒症状[9]、抗糖尿病[10]等功效。

植物基发酵饮料指以植物、发酵菌等为原料，通过微生物发酵获得的特定生物活性成分制成的产品[11]。近年来，植物发酵制品风靡全球，微生物发酵促进了底物分解转化，可以改善食品风味，提高营养价值[12]。作为21世纪新型保健功能饮料，植物发酵饮料营养价值高、保健效果好，能够满足人们对生活品质的追求和健康的饮食习惯。发酵后的果蔬不仅能提高其风味，还会产生丰富的氨基酸等成分，提升原料的质感，增加风味复杂度和饱和度，同时还能天然降糖，有助于人体健康[13]。随着消费不断的升级、消费群体的不断细分、消费方案逐渐细化和多样化，功能饮料的开发将得到持续的支持和推动。将功能、口感、饮用场景与发酵结合可能会是饮料企业下一步的研究方向和热点。当前市场上常见的雪莲果加工产品主要有果冻[14]、果脯[15]、饮料[16]、糕点[17]等。雪莲果发酵型饮料的研究较少，将雪莲果果汁与植物乳杆菌相结合，兼顾了营养与健康，是一款新型特色发酵型饮料产品。

本实验拟选用雪莲果为原料，以植物乳杆菌BNCC194165为菌种发酵，利用单因素试验考察蔗糖添加量、稳定剂添加量、菌种接种量、发酵时间等因素对雪莲果植物乳杆菌发酵饮料感官评分和总酸含量的影响，并通过响应面优化设计最佳生产工艺及参数，研制出营养丰富、口感清爽的雪莲果植物乳杆菌发酵饮料，丰富了饮料市场品种，拓宽了植物发酵饮料的生产链，为雪莲果的开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雪莲果、蔗糖：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BNCC194165：北京北纳创联生物技术研究院；阿拉伯胶：河南万邦实业有限公司；维生素C（vitamin C，VC）：成都万象宏润生物科技有限公司；氯化钠（NaCl）：云南省盐业有限公司。

1.2 仪器与设备

HT118ATC手持糖度仪：上海楚工实业有限公司；YXQLS-100SII立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；SW-CJ-2F标准型净化工作台：苏州安泰空气技术有限公司；LRH-250智能生化培养箱：郑州生元仪器有限公司；FE28数字型pH计：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；WT20002电子天平：杭州万特衡器有限公司；LC-4014低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；JYL-Y6榨汁机：九阳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雪莲果发酵饮料制备工艺流程及操作要点

操作要点：

雪莲果汁的制备：选择水分充足，大小适中的新鲜雪莲果，洗净后切成大小均匀的块状，置于护色液（1.5%NaCl+2%VC）中浸泡1 h，取出榨汁，用60目筛过滤得到雪莲果汁；

调配：在过筛后的雪莲果汁中加入8%的蔗糖和0.6%的阿拉伯胶，搅拌成均匀的溶液，过滤除去杂质，得到质地均匀的雪莲果汁，罐装入干净玻璃瓶中。

灭菌：灌装后放入立式压力蒸汽灭菌器中灭菌，主要目的是为了杀死其中有害微生物，防止在后续的发酵过程中干扰微生物的接种发酵，采用100 ℃，灭菌15 min。制成雪莲果汁调配液，冷却备用。

菌种活化：将菌种培养液放入依氏烧瓶中，用封口膜密封，将其置入蒸汽灭菌锅中121 ℃维持15 min，取出后置于超净工作台冷却至37 ℃，接入植物乳杆菌，在培养箱中培养24 h。

发酵：将活化完成的植物乳杆菌接种于冷却至40 ℃的雪莲果汁调配液中，密封后放入培养箱中进行发酵。

过滤：将发酵完成的雪莲果植物乳杆菌发酵饮料经100目纱布过滤，保留滤液。

罐装、密封：发酵滤液装入干净的玻璃瓶中并密封，防止微生物、杂质进入影响饮料品质。

灭菌、冷却：采用沸水灭菌15 min，灭菌完毕后放入冷水浴中迅速冷却至室温，制成雪莲果植物乳杆菌发酵饮料。

1.3.2 试验设计

（1）单因素试验

以感官评分及总酸含量为评价指标，考察蔗糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、阿拉伯胶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、植物乳杆菌接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、发酵时间（12 h、14 h、16 h、18 h、20 h）对雪莲果植物乳杆菌发酵饮料品质的影响。

（2）Plackett-Burman试验设计

在单因素试验基础上运用Design-expert 8.0.6软件设计12次的Placket-Burman试验对蔗糖添加量（X1）、菌种接种量（X2）、发酵时间（X3）、阿拉伯胶添加量（X4）进行感官评分（Y）显著性考察，每个因素设计高（1），低（-1）2个水平，PB设计因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

（3）响应面试验设计

在Plackett-Burman试验的基础上，选取蔗糖添加量（X1）、菌种接种量（X2）、发酵时间（X3）作为响应面试验的影响因子，以感官评分（Y）作为响应值，通过Box-Behnken设计进行3因素3水平试验，优化雪莲果植物乳杆菌发酵工艺，因素及水平见表2。

表2 雪莲果植物乳杆菌饮料发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of yacon beverage fermented with Lactobacillus plantarum

1.3.3 感官评分标准

雪莲果植物乳杆菌发酵饮料的感官评定由10名有一定品评经验的专业人员组成评定小组，分别从组织状态、气味、色泽、滋味四项指标对雪莲果植物乳杆菌发酵饮料采用百分制打分。评价标准及所占分值见表3，结果取平均感官评分作为综合评分。

表3 雪莲果植物乳杆菌发酵饮料感官评分标准Table 3 Sensory evaluation standards of yacon beverage fermented with Lactobacillus plantarum

1.3.4 理化指标及微生物指标的测定

总酸测定参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》；pH值的测定使用pH计；还原糖的测定参照GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》。

大肠菌群、菌落总数、霉菌分别按照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》、GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行测定。

1.3.5 数据处理

利用Excel 2013、SPSS 19.0统计软件处理单因素试验方差分析数据，工艺优化试验设计采用Design-Expert 8.0.6软件处理，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 蔗糖添加量的确定

饮料中加入蔗糖不仅可以提高饮料甜度，调节甜酸比和苦涩味，还可以提高其黏度和稳定性[18]。蔗糖添加量对产品品质的影响见图1。由图1可知，随着蔗糖添加量的增加，感官综合评价得分呈先增大后减小的变化趋势，总酸呈逐渐增加的趋势。当蔗糖添加量为8%时，感官评分最高，为（88.28±0.81）分。当蔗糖添加量为2%时，感官评分最低，为（74.50±0.23）分，原因可能是雪莲果本身甜度较低，而发酵过程中微生物生长代谢需要消耗一部分糖，同时产生有机酸[19]。蔗糖添加量过低，不利于植物乳杆菌发酵，且果汁过酸，受欢迎度降低。为避免酸甜比例失调，雪莲果发酵饮料中蔗糖的添加量需要较一般的非发酵类果蔬饮料偏高。因此，确定最适蔗糖添加量为8%。

图1 蔗糖添加量对产品品质的影响Fig.1 Effect of sucrose addition on product quality

2.1.2 阿拉伯胶添加量的确定

在植物饮料中添加适当的稳定剂可防止沉淀的产生，改善饮料的粘稠度，提高饮料品质和口感。阿拉伯胶具有良好的亲水性和亲油性，是较好的天然水包油型乳化稳定剂，可提高饮料的溶解度，使饮料更加稳定。因此，选择阿拉伯胶作为发酵饮料的稳定剂[20]。阿拉伯胶添加量对产品感官品质的影响结果见图2。由图2可知，随着阿拉伯胶的增加，感官评分呈先增大后减小的变化趋势，总酸变化趋势平缓。阿拉伯胶添加量为0.6%时，感官评分最高，为（89.67±0.36）分，这是由于阿拉伯胶可以和蛋白质在酸性条件下发生络合反应形成带电复合物，通过静电斥力防止蛋白质絮凝和沉淀，有助于稳定和提升饮料的组织状态及风味，并有一定的增稠作用[21]。添加量不足时，酸性蛋白质粒子间压力和重力平衡性差，仍会产生蛋白质沉淀[22]，添加过多破坏了饮料的稳定体系，影响了产品的流动性及适口性，品质变差。因此，阿拉伯胶最佳添加量为0.6%。

图2 阿拉伯胶添加量对产品品质的影响Fig.2 Effect of arabic gum addition on product quality

2.1.3 菌种接种量的确定

菌种接种量可以直接影响其在发酵体系中的生长，适当的菌种量可以保证溶氧充分，破坏细胞结构，使发酵液充分发酵[23]；但当菌种量过多时，发酵体系中的微生物含量增加，维持其生长代谢所需的营养物质增多，过量的菌种易产生过量的代谢废物，影响产品口感[24]。菌种接种量对雪莲果发酵产品感官质量的影响见图3。由图3可知，感官评分随菌种接种量的增大呈现先增大后减少趋势，总酸呈逐渐增加的趋势。在接种量为1%时，组织状态及风味均较好，感官评分达最高（87.11±0.36）分，随着接种量继续增加，产品过酸，口感不柔和，当植物乳杆菌接种量为2.5%时，感官评分最低，为（72.17±0.57）分，原因是植物乳杆菌接种量过多，导致乳酸菌在适宜条件下迅速繁殖，导致蔗糖和雪莲果汁中糖类迅速消耗，同时产生大量有机酸，使产品酸度过高，影响饮料整体风味和口感。菌种添加量低于1.0%，微生物生长缓慢，代谢效率低，产品风味不足。因此，最优菌种接种量为1%。

图3 接种量对产品品质的影响Fig.3 Effect of inoculum on product quality

2.1.4 发酵时间的确定

微生物发酵中，发酵时间对发酵体系影响较大，可影响发酵程度和产品品质，也可影响工艺及生产效率，是发酵食品开发中的重要参数。发酵时间过短，发酵不完全；时间过长，又会形成过多的酸性物质，影响饮料的风味。因此，确定合适的发酵时间是制作植物乳杆菌果汁饮品的必需步骤[25]。发酵时间对产品感官品质的影响结果见图4。由图4可知，发酵饮料的感官评分随发酵时间的增加呈先增大后减小的趋势，总酸呈逐渐增加的趋势。当发酵时间低于14 h时，饮料产品发酵不彻底，产品风味并未完成释放，产品品质是随着发酵时间延长逐渐提升，当发酵时间达到14 h时，饮料组织状态稳定且口感较好，感官评分达到最高（87.29±0.45）分；随着发酵时间的继续延长，产酸量过多，口感变差，尤其是酸涩感明显，同时伴有少量絮状杂质产生，影响产品外观、稳定性及口感风味，感官质量逐渐变差。因此，最适发酵时间为14 h。

图4 发酵时间对产品品质的影响Fig.4 Effect of fermentation time on product quality

2.2 Plackett-Burman试验设计及结果

Plackett-Burman试验设计方法可通过对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性，筛选及确定显著影响的因子，避免试验过程中因子数过多或某些因子不显著造成的实验资源过度浪费，PB试验设计与结果见表4。由表4可知，利用Design-Expert 8.0.6软件进行多元回归方程拟合和方差分析。得到回归方程为：Y=8.49+1.52X1+0.28X2+0.25X3+0.31X4-0.17X5。PB试验模型方差分析见表5。

表4 Plackett-Burman试验设计与结果Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests

表5 Plackett-Burman试验模型方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman test model

由表5可知，模型F＞1，P＜0.01，差异性极显著，表明模型设计合理。X1蔗糖添加量、X2菌种添加量、X3发酵时间对结果影响均为极显著（P＜0.01），X4阿拉伯胶添加量表现为不显著（P＞0.05），表明此因子对感官评分的影响不显著。模型的决定系数R2=97.95%，与调整决定系数R2Adj=96.79%接近，表明该模型可预测性及可信度较高。

根据前期单因素试验，在以雪莲果与水的料水比为1∶1的基础上将因子X4（阿拉伯胶添加量）设置为0.6%，对显著性因子蔗糖添加量（X1）、菌种添加量（X2）、发酵时间（X3）进行响应面优化试验，考察其最优水平范围。

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验结果及模型建立

基于Box-Behnken试验设计，在单因素试验和Plackett-Burman试验基础上，利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面优化试验，选取蔗糖添加量（X1）、菌种添加量（X2）、发酵时间（X3）3个因素，以感官评分（Y）为响应值，完成雪莲果植物乳杆菌发酵饮料发酵工艺优化，试验设计及结果见表6。

表6 Box-Behnken试验设计与结果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

续表

根据表6的结果，利用Design-Expert 8.0.6软件进行二元回归方程拟合和方差分析。回归方程为：Y=86.66+1.64X1+2.81X2+0.36X3-1.26X1X2-1.05X1X3-2.02X2X3-6.52X12-6.62X22-1.99X32。利用Design Expert 8.0.6软件对表6数据进行分析方差分析，结果见表7。

表7 回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，该回归模型的P＜0.000 1，说明回归模型的影响达到极显著水平（P＜0.01）；模型失拟项不显著，表明此模型可用于试验拟合。模型的决定系数R2=0.994 1，表明该模型能解析99.41%的响应变化，说明该模型拟合程度相对较好，试验误差较小。响应值Y的变异系数（coefficient of variation，CV）与试验精确度和重复性成反比，其变异系数CV=0.84%＜5%，说明试验的精确度和重复性较高，且可信度较高。由F值大小可以得出各因素对饮料感官品质的影响大小顺序为X2（菌种添加量）＞X3（发酵时间）＞X1（蔗糖添加量），一次项X2、X3的P值均＜0.01，表明其对饮料感官品质的影响极显著。

2.3.2 各因素交互作用响应面分析

响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映蔗糖添加量（X1）、菌种接种量（X2）、发酵时间（X3）之间交互作用对雪莲果植物乳杆菌感官评分的影响。曲面图弧度变化越陡峭，等高线越密集且呈椭圆形或马鞍形时，表示两因素之间交互作用越显著，各因素交互作用结果见图5。

图5 各因素间交互作用对雪莲果植物乳杆菌发酵饮料感官品质影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the sensory quality of yacon beverage fermented with Lactobacillus plantarum

由图5、表7可知，交互项X1X2、X2X3的曲面倾斜度较大，坡度较陡，且等高线呈椭圆形，较密集，说明其影响极显著（P＜0.01），与X1X2、X2X3相比，X1X3曲面倾斜度较小，坡面较平缓（P＜0.05），各因素间交互作用对雪莲果植物乳杆菌发酵饮料的感官评分的影响大小依次为X1X2＞X2X3＞X1X3。

2.4 雪莲果植物乳杆菌发酵饮料最佳发酵工艺的确定及验证试验

经过回归方程进一步拟合分析预测得出最佳发酵工艺为：蔗糖添加量7.91%、菌种接种量1.10%、发酵时间14.22 h。在此优化条件下，雪莲果发酵型饮料分值达到（87.26±0.36）分。考虑到实际操作的可行性，将发酵工艺条件修正为：蔗糖添加量8%、菌种接种量1%、发酵时间14 h。在优化发酵工艺条件下进行3次验证性试验，感官评分平均实际值为（87.42±0.32）分，与预测值接近，说明响应面优化后得到的最佳发酵工艺参数准确可靠，具有一定的实际应用价值。

2.5 产品质量评价

2.5.1 雪莲果植物乳杆菌发酵饮料感官指标

按照最优组合制备雪莲果发酵饮料，根据感官评分标准进行感官分析。开发的雪莲果植物乳杆菌发酵饮料最终产品均匀一致，颜色呈鲜亮的橘黄色，具有雪莲果及乳杆菌香气，层次丰富，无异味，酸甜适宜。

2.5.2 雪莲果植物乳杆菌发酵饮料理化指标及微生物指标

理化指标及微生物指标见表8。由表8可知，在该工艺下制得的雪莲果植物乳杆菌发酵饮料酸甜适中，且微生物指标符合相关国家安全标准。

表8 理化指标及微生物指标结果Table 8 Results of physical and chemical indicators and microbial indicators

3 结论

本研究以雪莲果为原料，植物乳杆菌BNCC194165为发酵菌种，通过单因素试验、Plackett-Burman试验及响应面试验优化雪莲果植物乳杆菌发酵饮料发酵工艺。结果表明，雪莲果植物乳杆菌发酵饮料的最佳发酵工艺为雪莲果与水质量比为1∶1，蔗糖添加量8%、阿拉伯胶添加量0.6%、植物乳杆菌BNCC194165接种量1%、37 ℃发酵14 h的条件下，感官评分为（87.42±0.32）分。按照该工艺所得的雪莲果植物乳杆菌发酵饮料兼具雪莲果及植物乳杆菌的清香，清新爽口，酸甜适中，其理化及微生物指标符合相关标注要求，是一款风味品质较佳的发酵型植物饮料。本产品的研发对延伸雪莲果产业链、丰富特色果蔬发酵饮料品类具有一定的意义。