西藏林芝地区不同品种葡萄果实表皮微生物群落结构组成分析

何 萍，王健强，高 潭，陈诚欣，徐雨婷，简 阅，刘盼盼，张二豪

（西藏农牧学院 食品科学学院，西藏 林芝 860000）

西藏林芝市位于西藏东南部，雅鲁藏布江中下游，平均海拔3 100 m，其独特的高原气候类型赋予了该地区昼夜温差大、光照充足和紫外线强的特点，为果树种植提供了得天独厚的生长环境，因此，素有“西藏江南”和“水果之乡”的美称。

葡萄（Vitis viniferaL.）为葡萄科葡萄属多年生木质藤本植物，是栽培历史悠久、栽培面积最大的水果之一[1]。目前，全球葡萄品种数量巨大，超过23 000种[2]，由于其富含维生素、蛋白质、有机酸及矿物质等营养成分深受消费者的青睐[3-5]。在我国，葡萄主要用于鲜食，其次是酿酒和制干[5]，但从世界范围来看，葡萄主要用于酿酒，其次是鲜食和制干[6]。随着人们生活水平的提高和健康意识的增强，葡萄酒作为一种功能保健品深受广大消费者的青睐。葡萄酒具有抗癌、降血糖、抗氧化及增强免疫力等功效[7]，但葡萄酒品质受葡萄品种、酿造工艺、产地和表皮微生物等因素影响[8]。葡萄酒酿造的本质是一系列微生物发酵和代谢的过程，其中酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和霉菌在发酵过程中扮演着重要角色[9]，而这些微生物主要来源于葡萄表皮和发酵设备[10-11]。研究表明，在葡萄酒酿造过程中，葡萄果实表皮微生物葡糖杆菌属（Gluconobacter）等能促进酯类物质的合成，进而改善葡萄酒的品质，乳酸菌属（Lactobacillus）等则会产生异味，影响葡萄酒的感官[12]；本土酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能够显著提升酒的风味物质[13]；增芳德葡萄表皮上的非酿酒酵母泽普林假丝酵母（Candida zemplinina）能增强葡萄酒的口感[14]。葡萄表皮微生物受产地、品种和环境等因素影响，张世伟等[15]研究表明，不同品种葡萄表皮微生物群落结构组成存在明显差异；赵昱等[16]研究表明，不同产区酿酒葡萄表皮微生物存在一定的差异。综上所述，葡萄表皮微生物在葡萄酒酿造过程中扮演着重要角色，且受产地、品种、气候和环境等因素的影响。西藏林芝市具有独特的地理位置和气候类型，蕴藏着丰富的微生物资源，因此，探明林芝地区不同品种葡萄果实表皮微生物群落结构组成，对筛选利用功能微生物具有重要意义。

本研究利用高通量测序技术对西藏林芝地区的‘夏黑’、‘火焰无核’、‘茉莉香’和‘玫瑰香’葡萄果实表皮微生物群落结构组成进行分析，揭示不同品种葡萄果实表皮微生物多样性，为葡萄种植管理和筛选利用本土优质的微生物资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品的采集与处理

2021年8月从西藏林芝市嘎玛农场（纬度29°24'44.74"N，经度94°26'26.86"E）采集‘夏黑’（Summer Black）、‘火焰无核’（Flame Seedless）、‘茉莉香’（Jasmine）和‘玫瑰香’（Muscat Hamburg）共4个品种的葡萄果实样品，编号分别为XH、BL、ML、MG。随机选取10株生长一致的葡萄树（10年生），用无菌剪刀分别采集每株葡萄树上、中、下部位的成熟果实，并混合均匀，置于无菌袋中，每组3个重复，-20 ℃保存备用。

称50 g葡萄样品，加入200 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）（pH7.0），200 r/min涡旋30 min，超声处理20 min，经0.22 μm无菌滤膜过滤后，取出滤膜并剪碎置于无菌离心管中[16]，-80 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

DNeasy Plant Mini Kit提取试剂盒：美国Qiagen公司；Taq脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5.0 U/μL）、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（5 mmol/L）、普通DNA产物纯化试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖、Qubit2.0 DNA检测试剂盒：美国Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TD-GelX 1520凝胶成像系统、T100聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）仪：美国Bio-rad公司；WS600电泳仪：万生博朗电子有限公司；NanoDrop2000微量分光光度计：美国Thermo公司；5424、5418R离心机：德国Eppendorf公司；IMS-20制冰机：上海精密仪器仪表有限公司；UPT-I-5T优普系列超纯水器：四川优普超纯科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄果实样品表皮宏基因组DNA的提取

利用DNeasy Plant Mini Kit提取试剂盒提取12个葡萄样品果实表皮微生物总DNA，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，采用NanoDrop2000微量分光光度计检测DNA浓度和纯度。

1.3.2 PCR扩增

利用细菌16S rRNA基因V3-V4区通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和真菌内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）通用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）进行PCR扩增。PCR扩增体系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.0 μL，TaqDNA聚合酶（5.0 U/μL）0.20 μL，正、反向引物各1μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTPs）（5 mmol/L）1 μL，DNA模板1 μL，双蒸水（ddH2O）18.80 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃再延伸10min，4 ℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和纯化回收后委托上海派森诺科技股份有限公司进行测序。

1.3.3 数据处理及分析

利用QIIME2（2019.4）软件对Illumina MiSeq测序所得的原始序列进行去噪、拼接和质控后，使用Vsearch（v2.13.4）软件，在97%的相似度水平下对高质量序列进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类；用Greengenes数据库（Release 13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）和UNITE数据库（Release 8.0，https：//unite.ut.ee/）分别对细菌和真菌进行物种分类学注释；利用QIIME2（2019.4）软件和R语言计算各样本的Alpha多样性和样品间的Beta多样性；利用R语言工具进行数据转换和作图。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果分析

高通量测序结果见表1。由表1可知，4个葡萄品种果实表皮细菌菌群共产生1 570 843条有效序列，其中XH、BL、ML和MG样品果实表皮分别获得370 681、392 649、409 586和397 927条有效序列，平均序列碱基长度为407 bp。4个葡萄品种果实表皮真菌菌群共产生1 438 032条有效序列，其中XH、BL、ML和MG样品表皮分别获得338 757、387 540、329 897和381 838条有效序列，平均序列碱基长度为217 bp。葡萄果实表皮微生物测序覆盖度在0.982 0～0.999 9之间，说明此次测序结果能真实反应样品表皮微生物的菌落结构组成。

表1 不同品种葡萄样品果实表皮微生物菌群高通量测序结果Table 1 Results of high throughput sequencing of microbial community on the different varieties of grape fruit surface

2.2 Alpha多样性结果分析

Alpha多样性指数包括Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数等，常用来反映样品中微生物的丰富度和多样性，Chao1指数表征丰富度，值越大表明群落的丰富度越高；Shannon指数和Simpson指数表征多样性，Shannon指数值越大、Simpson指数越小表明群落多样性越高[17]。不同品种葡萄样品果实表皮微生物菌群的Alpha多样性分析结果见图1。由图1可知，XH样品果实表皮微生物丰富度和多样性指数最高，其次是样品ML，样品BL最低。结果表明，不同品种葡萄果实表皮微生物多样性和丰富度存在差异。

图1 不同品种葡萄样品果实表皮微生物群落alpha多样性分析结果Fig.1 Analysis results of alpha diversity indexes of microbial community on the different varieties of grape fruit surface

2.3 微生物群落结构分析

2.3.1 不同葡萄品种果实表皮微生物菌群OTU分析

基于97%相似度的分类水平，4个葡萄品种果实表皮细菌菌群共注释到705个OTUs，其中，XH、BL、ML和MG样品所产生的OTUs数分别为266、110、184和145个；4个葡萄品种果实表皮真菌菌群共注释到615个OTUs，其中，XH、BL、ML和MG样品所产生的OTUs数分别为186、119、164和146个。不同品种葡萄果实表皮微生物所获得OTUs数不同，XH样品最多，BL样品最少，说明不同品种葡萄果实表皮微生物群落结构组成差异较大。通过韦恩图能够展示出不同样品间共同拥有和特有的OTU数目，也直观反映了不同样品中OTU数目的差异性[18]。绘制不同葡萄品种果实表皮微生物菌群的OTU韦恩图，结果见图2。由图2A可知，XH、BL、ML和MG样品特有的细菌OTUs数分别为181、48、103和69个，共有的细菌OTUs数为32个，占总数的4.54%，说明不同品种葡萄果实表皮细菌群落结构组成差异较大；由图2B可知，XH、BL、ML和MG样品特有的真菌OTUs数分别为114、54、112和82个，共有真菌OTUs数为19个，占总数3.08%，说明不同品种葡萄果实表皮真菌群落结构组成差异较大。综上，不同品种葡萄果实表皮微生物群落结构组成差异较大。

图2 不同品种葡萄样品果实表皮细菌（A）和真菌（B）菌群OTU韦恩图Fig.2 Venn diagrams of OTU of bacterial (A) and fungal (B)community on the surface of grape fruit of different varieties

2.3.2 不同葡萄品种果实表皮微生物种群归类分析

微生物种群归类分析结果见表2。由表2可知，XH样品表皮细菌归属于15门、23纲、39目、50科和66属；MG样品表皮细菌归属于12门、18纲、33目、39科和49属；BL样品表皮细菌归属于10门、16纲、27目、31科和36属；ML样品表皮细菌归属于11门、16纲、32目、41科和49属。XH样品表皮真菌归属于5门、11纲、20目、27科和30属；MG样品表皮真菌归属于4门、11纲、17目、23科和27属；BL样品表皮真菌归属于4门、9纲、16目、19科和24属；ML样品表皮真菌归属于5门、11纲、18目、23科和29属。葡萄果实表皮微生物在各分类等级上的数量各不相同，XH样品果实表皮微生物在各分类等级上的数量最多，BL样品果实表皮最少，且细菌多于真菌，说明不同品种葡萄果实表皮微生物多样性存在差异。

表2 不同葡萄样品果实表皮微生物菌群归类分析结果Table 2 Classified analysis results of microbial community on the surface of grape fruit with different varieties

2.3.3 基于门分类水平不同品种葡萄样品果实表皮微生物群落结构组成

在门分类水平上，不同葡萄样品果实表皮细菌及真菌群落结构组成见图3。

图3 基于门分类水平不同品种葡萄样品果实表皮细菌（A）及真菌（B）的群落结构组成Fig.3 Composition of bacterial (A) and fungal (B) community on the grape surface of different varieties based on phylum level

由图3A可知，XH样品中的优势细菌门（相对丰度＞1%）为变形菌门（Proteobacteria）（62.26%）、放线菌门（Actinobacteria）（12.09%）、厚壁菌门（Firmicutes）（7.51%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（5.83%）、疣微菌门（Verrucomicrobia）（4.18%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（1.87%）和髌骨细菌门（Patescibacteria）（1.38%）；MG样品中的优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）（64.39%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（21.50%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（4.20%）、厚壁菌门（Firmicutes）（2.53%）、放线菌门（Actinobacteria）（2.52%）和酸杆菌门（Acidobacteria）（1.36%）；BL样品中的优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）（52.45%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（33.06%）、厚壁菌门（Firmicutes）（3.21%）、放线菌门（Actinobacteria）（2.95%）、酸杆菌门（Acidobacteria）（2.45%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（1.75%）、髌骨细菌门（Patescibacteria）（1.49%）和浮霉菌门（Planctomycetes）（1.01%）；ML样品中的优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）（75.93%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（7.48%）、放线菌门（Actinobacteria）（3.53%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（3.40%）、厚壁菌门（Firmicutes）（3.34%）和酸杆菌门（Acidobacteria）（2.36%）。以上结果表明，不同样品中的优势细菌门类型基本相同，但相对丰度差异较大。有研究表明，霞多丽葡萄和美乐葡萄果实表皮上的优势细菌门是变形菌门[19-20]；张世伟等[15]研究表明，不同品种葡萄表皮细菌主要分布在8个已知的门，如变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、醋杆菌门、芽单胞菌门、绿弯菌门和栖热菌门（Thermi），其中变形菌门是优势细菌门。这与本研究结果一致，林芝地区不同品种葡萄果实表皮上的优势细菌门是变形菌门，但在主要细菌门类型上又存在差异，这可能与西藏特殊的气候类型和葡萄品种等因素有关。

由图3B可知，XH样品的优势真菌门（相对丰度＞1%）为子囊菌门（Ascomycota）（86.04%）、担子菌门（Basidiomycota）（8.64%）和油壶菌门（Olpidiomycota）（1.01%）；MG和BL样品中的优势真菌门均为子囊菌门（Ascomycota），其相对丰度分别为99.23%和99.77%；ML样品中的优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota）（95.94%）和担子菌门（Basidiomycota）（1.32%）。不同葡萄样品果实中的主要优势真菌门均为子囊菌门。有研究表明，子囊菌门是葡萄表皮的优势菌门[15-16，21-22]，这与本研究结果一致。

2.3.4 基于属分类水平不同葡萄样品果实表皮微生物群落结构组成

在属分类水平上，不同葡萄样品果实表皮细菌及真菌群落结构组成见图4。

由图4A可知，XH样品中的优势细菌属（相对丰度＞1%）为伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）（8.69%）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）（7.26%）；伯克霍尔德氏菌属（21.46%）和SJA-15（20.53%）是MG样品中的优势细菌属；SJA-15（32.35%）和伯克霍尔德氏菌属（14.38%）是BL样品中的优势细菌属；ML样品中的优势细菌属为伯克霍尔德氏菌属（21.52%）和SJA-15（5.52%）。研究表明，伯克霍尔德氏菌属细菌能够在污染土壤及水体中快速定植和生长，具有降解农药残留的功效[23]，说明林芝地区葡萄种植地土壤可能存在污染和农药残留。

图4 基于属水平不同品种葡萄样品果实表皮细菌（A）及真菌（B）群落结构组成Fig.4 Composition of bacterial (A) and fungal (B) community on the grape surface of different varieties based on genus level

由图4B可知，球腔菌属（Mycosphaerella）（52.93%）和曲霉属（Aspergillus）（10.95%）为XH样品中的优势真菌属（相对丰度＞1%）；球腔菌属（57.31%）和枝孢属（Cladosporium）（9.39%）为MG样品中的优势真菌属；BL样品中的优势真菌属为球腔菌属（82.99%）和枝孢属（8.84%）；ML样品中的优势真菌属为球腔菌属（43.91%）和枝顶孢属（Acremonium）（33.85%）。张世伟等[15]研究表明，不同品种酿酒葡萄表皮真菌主要分布在9个属，即链格孢菌属（Alternaria）、镰孢属（Fusarium）、枝孢属（Cladosporium）、耐冷酵母属（Guehomyces）、孢霉属（Mortierella）、茎点霉属（Phoma）、黑附球菌属（Epicoccum）、隐球菌属（Cryptococcus）和漆斑霉属（Myrothecium），这与本研究结果差异较大，可能与产地、气候和品种等因素有关。有研究表明，球腔菌属是多种农林作物的致病菌，如甜瓜球腔菌能引起黄瓜蔓枯病[24]，落叶松葡萄座腔菌能引起落叶松的落针病[25]，香蕉黑条叶斑病菌能使香蕉致病[26]。不同品种葡萄果实表皮的主要优势真菌属均为球腔菌属，其相对丰度在43.91%～82.99%之间，说明西藏林芝地区葡萄可能存在致病菌感染的风险。曲霉属是常见的食品、粮食和环境污染菌，但曲霉也能产生各种有机酸、酶类和抗生素等有益的化合物[27]。曲霉属是XH样品中的优势真菌属，其功能有待进一步确定。枝孢属广泛存在于土壤和植物体内，能合成多种类型的化合物，如生物碱、醌类、萜类和醌类等[28]；枝顶孢属是一类以腐生、寄生和自生为主的真菌，目前约有130种，部分枝顶孢属真菌能产生多种具有生物活性的化合物，如恩醌类、萜类和酚类等，同时还具有抑菌作用[29]；MG和BL葡萄果实表皮富含丰富的枝孢属真菌，ML葡萄果实表皮富含丰富的枝顶孢属真菌，说明MG、BL和ML葡萄样品果实表皮可能存在具有生物活性功能的益生微生物。

2.4 Beta多样性差异分析

为了分析生物群落结构组成上的差异，基于相对丰度前20的细菌和真菌属对不同品种葡萄表皮菌落进行聚类分析，结果见图5。

图5 基于属水平不同品种葡萄样品表皮相对丰度前20的细菌（A）和真菌（B）聚类分析结果Fig.5 Cluster analysis results of relative abundance top 20 bacterial(A) and fungal (B) community on grape surface of different varieties based on genus level

由图5A可知，BL和ML样品聚为一支，而XH和MG样品与BL和ML样品间聚类较远，说明BL和ML样品果实表皮细菌群落结构组成较其他样品相似，而XH和MG样品与BL和ML样品果实表皮细菌群落结构组成差异较大。

由图5B可知，MG和BL样品聚为一支，而与其他样品间距离较远，说明MG和BL样品果实表皮真菌群落结构组成较其他样品相似。以上结果表明，不同品种葡萄果实表皮微生物群落结构组成存在差异，葡萄品种类型是影响葡萄果实表皮微生物的关键因素。

3 结论

西藏林芝地区不同品种葡萄果实表皮微生物群落多样性差异明显，‘夏黑’葡萄果实表皮微生物丰富度和多样性指数最高；不同品种葡萄果实表皮优势细菌属主要分布在伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、SJA-15、劳尔氏菌属（Ralstonia）、异样根瘤菌属（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）和阿菲波菌属（Afipia），优势真菌属主要分布在球腔菌属（Mycosphaerella）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢属（Cladosporium）和枝顶孢属（Acremonium）。不同品种葡萄果实表皮微生物群落结构组成及相对丰度差异明显，说明葡萄品种影响葡萄果实表皮微生物群落结构组成。