一株固态发酵豆粕的枯草芽孢杆菌的分离与应用

陈倩倩， 葛慈斌，刘 波， 王阶平， 刘国红， 车建美， 李慧敏， 刘 欣

（福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州 350002）

豆粕是大豆加工后的副产物，是畜禽饲料中重要的蛋白质原料，但豆粕中的粗纤维难以消化吸收，会增加畜禽肠道负担，降低营养转化率。微生物能够转化利用饲料中不易分解的大分子物质，促进饲料中的物质转化，提高饲料营养物质的吸收利用率（Bi等，2015；Kim等，2010）。同时，微生物可产生多种胞外酶，促进饲料中纤维素等难利用物质的转化（Zhang等，2018；Alnahdi等，2012）。研究表明，在饲粮中添加纤维素酶制剂能有效地将纤维素转化为糖类物质，提高饲料的吸收率（张煜等，2018；Meinlschmidt等，2016）。因此，筛选获得高产纤维素酶的菌种，应用于豆粕发酵中，可将饲料中难消化的粗纤维细化，提高发酵饲料的营养价值。

细菌、真菌和放线菌都能够合成纤维素酶，细菌由于环境适应能力强、底物范围广，且易培养、生长周期短的特性，而被广泛应用。芽孢杆菌和乳酸菌是发酵饲料生产中常用的菌株。其中，芽孢杆菌能够产生具有抗逆性的芽孢，对高温、干燥和盐碱等都有很强的抗性，能适应发酵环境，具有广阔的应用前景（Chi等，2016）。此外，芽孢杆菌能够产生抗菌物质抑制病原微生物，有效避免饲料污染，减少抗生素在饲料中的应用（陈倩倩等，2020；邱博书等，2019）。已有研究表明，添加芽孢杆菌发酵饲料可降低断奶仔猪腹泻的发生率，维持肠道菌群平衡（Gao等，2020；Seo等，2016）。

本文针对畜禽饲料中纤维素难以降解，分解转化率低的问题，旨在筛选耐受发酵高温的芽孢杆菌，并研究其产酶特性，以期利用菌株产酶解决豆粕纤维素难以降解的问题，利用其抑菌特性解决豆粕发酵的杂菌污染问题，提高发酵饲料的营养价值和安全性，促进发酵饲料的发展与应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验菌株：芽孢杆菌和青霉菌为本实验室分离保藏菌株。

酶活试剂：3，5-二硝基水杨酸（3，5-DNS）显色液、柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 4.5）、1%羟甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液、标准葡萄糖溶液（1.00 mg/mL）、碘化钾混合液（1 mg/mL）。

培养基：Luria-Bertani（LB）培养基：酵母提取物10.0 g，NaC1 5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，水1000 mL，pH 7.2~7.4。LB-CMC培养基：羧甲基纤维素钠1%+LB培养基。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：土豆200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH 7.2~7.4。固体培养基按15~20 g/L的比例添加琼脂。

PCR试剂：10×Buffer、dNTP（10 mM/each）、Taq酶（2.5 U/μL），上海博尚生工生物工程技术服务有限公司；ITS、16S rDNA引物和100 bp Marker，上海英骏生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 耐高温产纤维素酶芽孢杆菌筛选 菌株分离自福建莆田江口镇葡萄园葡萄根系土壤。取葡萄根系土壤10 g，加入90 mL无菌水，振荡混匀。80℃水浴10 min后，进行梯度稀释后涂布于细菌培养基平板上，于55℃下培养2~3 d，获得纯培养芽孢杆菌菌株，命名为FJAT-5561。根据API50CH碳水化合物鉴定试剂条说明书进行菌株生理生化鉴定。同时，采用Tris-饱和酚法提取菌株FJAT-5561基因组DNA，并利用16S rRNA序列通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增（Rainey等，2010）。PCR产物送至上海铂尚生物技术有限公司测序。通过对测序获得的基因序列的比对与分析，确定芽孢杆菌FJAT-5561分类地位（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/）。

将芽孢杆菌FJAT-5561接种于LB固态培养基中，30℃活化培养24 h，再接种至LB-CMC固体培养基，55℃培养48 h。采用刚果红染色法检测菌株是否产纤维素酶，测定水解透明圈直径（H）和菌落直径（D）大小，根据H/D比值初步判定高温环境下菌株产纤维素酶的能力。

将活化后的芽孢杆菌按2%的接种量转移至LB-CMC液体培养基，进行复筛。55℃、170 r/min培养48 h后，取发酵液6000 r/min离心10 min，上清即为粗酶液。采用3，5-二硝基水杨酸显色法测定其活性：向20 mL试管中加入3 mL CMC-Na溶液（50℃水浴下孵育3 min），然后加入1.0 mL稀释后的粗酶液，50℃水浴反应30 min。沸水浴10 min使纤维素酶失活，然后加入3 mL DNS沸水浴10 min进行显色，在540 nm波长下测定吸光值。空白组采用煮沸失活的粗酶液为对照。在上述试验条件下，每分钟每毫升水解淀粉释放1 μmol葡萄糖所需酶量定义为一个酶活力单位（U）。

1.2.2 纤维素酶酶学特性研究

1.2.2.1 pH对芽孢杆菌纤维素酶活性的影响按2%的接种量将芽孢杆菌接种至不同pH（4.0~9.0）的发酵培养基，发酵培养48 h。以各个发酵培养基灭活的粗酶液作为对照。

1.2.2.2 温度对芽孢杆菌纤维素酶活性的影响将芽孢杆菌于25~65℃（梯度10℃）下培养48 h，测定酶活力。以各温度发酵培养基灭活的粗酶液纤维素酶活性作为对照。

1.2.3 产酶芽孢杆菌抑菌活性分析 芽孢杆菌接种于100 mL LB培养液中培养2 d，0.22 μm滤膜过滤，获得菌株发酵上清液。将青霉FJAT-110在PDA培养基上30℃培养5 d，取孢子制备106cfu/mL的孢悬液。制备PDA双层板，下层为固体PDA培养基，上层为半固体PDA培养基（琼脂含量减半）。在平板中间打孔，注入芽孢杆菌发酵上清液100 μL，以无菌水为阴性对照，0.1 mg/mL潮霉素为阳性对照，观察抑菌圈（邱博书等，2019）。同时，将发酵上清液稀释1、2、4、8、16倍，观察不同浓度的上清液对青霉的抑制效果。取抑菌圈附近的菌块，电镜观察芽孢杆菌对青霉菌丝生长及结构形态的影响。

抑菌率/%=（菌落直径-打孔直径）/（对照直径-打孔直径）×100。

1.2.4 芽孢杆菌发酵豆粕试验 豆粕发酵基础培养基：2250 g豆粕中添加250 g麸皮，按10%的接种量（V/V）加入活化后的菌液，调整含水量至50%。35℃发酵7 d，完成发酵。于发酵起始（0 d）和发酵结束（7 d）取样，分别进行理化性质和微生物鉴定。

理化性质检测：饲料中的黄曲霉素和玉米赤霉烯酮采用标准NY/T 2071-2011要求检测，脱氧雪腐镰刀菌烯醇和赭曲霉毒素按照GB/T 30956-2014要求检测。同时，检测发酵豆粕中的粗纤维（GB/T6434-2006）、粗蛋白质（GB/T6432-2018）、脂肪（GB/T6433-2006）和含水量等理化指标。

微生物分离鉴定：对样品进行梯度稀释后，涂布于固体LB/PDA培养基，分离发酵后豆粕中霉菌和芽孢杆菌，分别进行ITS、16S rDNA鉴定。霉菌采用百泰克公司的离心柱型试剂盒进行DNA提取，采用特异引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 和ITS5（5'-GGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGG-3'）进 行PCR扩 增（刘少军等，2019）。芽孢杆菌的16S rDNA鉴定按照1.2.1耐高温产纤维素酶芽孢杆菌筛选中所描述的方法进行。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶芽孢杆菌筛选FJAT-5561可以与葡萄糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、棉子糖、淀粉、肝糖等发生反应，FJAT-5561的生理生化鉴定结果为Bacillus subtilis，鉴定分数为99.6%（表1）。

表1 菌株FJAT-5561的生理生化结果

经测序获得1050 bp的16S rDNA序列。根据16S rDNA基因序列比对分析（图1），确定分离自福建莆田江口镇葡萄园葡萄根系土壤的FJAT-5561为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。初筛结果显示枯草芽孢杆菌在55℃条件下能降解CMC-Na，产生透明圈，其H/D为3.6（图2）。复筛结果显示枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵上清液能够降解CMC-Na释放葡萄糖，纤维素酶活性为0.60 U/mL。枯草芽孢杆菌是广泛应用于饲料行业的益生菌，能够分泌多种胞外酶，促进原材料中的纤维素降解为淀粉和葡萄糖，提高饲料的吸收率（王格等，2018）。

图1 FJAT-5561菌株的系统进化树

图2 FJAT-5561在LB-CMC培养基上产生的透明圈

2.2 纤维素酶酶学特性研究 将枯草芽孢杆菌FJAT-5561在55℃下发酵培养，观察其在不同pH培养基中的酶活性。结果显示FJAT-5561在pH为8，酶活最高达0.75 U/mL（图3）。进一步研究不同温度下的酶活性。检测结果显示，在25~45℃，枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵上清液的酶活性呈上升趋势，即在45℃，其发酵上清液酶活性最高，达0.90 U/mL。通过调整培养温度和酸碱度，初步获得枯草芽孢杆菌FJAT-5561最佳产酶温度和pH。枯草芽孢杆菌FJAT-5561在45℃、pH为8时的酶活性达0.90 U/mL，较起始状态提高了50%，提升了产酶效果。

图3 枯草芽孢杆菌FJAT-5561在不同pH（a）和温度（b）下纤维素酶活性变化

2.3 产酶芽孢杆菌抑菌活性分析 枯草芽孢杆菌FJAT-5561的抑菌试验结果显示，其对青霉菌具有抑制效果，抑菌率为84.2%。FJAT-5561上清液稀释8倍后依然具有抑菌效果（图4）。扫描电镜观察结果同样证明，FJAT-5561对青霉具有良好的抑制效果。与清水对照相比，FJAT-5561发酵上清液使青霉菌丝变形和萎缩，抑制菌丝生长，从而达到抑制效果（图5）。青霉是引发饲料霉变的主要真菌，产生的真菌毒素危害畜禽健康（刘少军等，2019；李晓雪等2018）。芽孢杆菌对多种真菌具有抑制效果，具有抑菌谱广，耐受性强的优点（满丽莉等，2019；Parrado等，2014）。筛选具有抗菌活性的芽孢杆菌，进行豆粕发酵，能够抑制环境中的青真菌污染饲料，进而保证发酵饲料的生物安全。产纤维素酶芽孢杆菌FJAT-5561兼具高产酶、抗病青霉菌、耐高温和酸碱的能力，适用于发酵饲料的研发。2.4发酵豆粕理化性质分析 添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵豆粕，发酵后物料中的粗纤维含量为4.2%（干重），低于对照组的4.6%。芽孢杆菌产生的胞外酶能够降解饲料中的粗纤维，促进转化吸收（Zhao等，2015）。此外，芽孢杆菌的胞外酶能够破坏豆粕表面的纤维结构，增大接触面积，促进蛋白质、脂肪等营养物质的降解（Wang等，2012）。在菜籽粕发酵过程中，观测其中的蛋白质、纤维素与多糖等大分子的降解过程，其中纤维素是最先降解的物质，其次是多糖、蛋白质（Hamidoghli等，2020）。因此，纤维素酶除了能够降解纤维素，同时还可以释放豆粕颗粒内部的大分子物质，促进蛋白质与多糖的分解利用，提高豆粕转化效率。

图4 枯草芽孢杆菌FJAT-5561对青霉抑制作用

图5 枯草芽孢杆菌FJAT-5561对青霉抑制作用的电镜观察（a：清水；b：B.subtilis FJAT-5561）

添加枯草芽孢杆菌发酵可以提高发酵豆粕粗 蛋 白 质 含 量 （Medeiros等，2018；Shiu等，2015）。添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵豆粕，发酵7 d后豆粕中的粗蛋白含量为52.7%，对照组为48.5%，比对照组对高了4.2个百分点。同样地，研究发现添加枯草芽孢杆菌E20发酵72 h后，豆粕中的蛋白质升高了19%，达50.2%（Pleadin等，2019）。豆粕发酵过程中，微生物的增殖导致碳水化合物的大量消耗，其消耗速度远高于蛋白质的消耗，进而提高了粗蛋白质的相对含量。总之，相比较未添加菌剂的对照组，添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561进行发酵降低了豆粕中难以利用的粗纤维含量，提升了豆粕中的粗蛋白质含量。

2.5 发酵豆粕微生物分离鉴定 真菌毒素是由曲霉菌属和镰刀菌属各种真菌产生的次生代谢产物，污染饲料，对人类和动物健康造成严重危害。由于真菌在自然界中分布广泛，农产品、食品和饲料中都存在真菌毒素的隐患（Chesson等，2008）。本试验结果表明，添加和未添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵，豆粕中均未检出黄曲霉素、赭曲霉毒、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镶刀菌烯醇等真菌毒素。然而，添加枯草芽孢杆菌发酵7 d后未检出黄曲霉，而未添加菌剂的发酵饲料中检测到了黄曲霉（表3）。黄曲霉的存在具有潜在安全隐患。添加芽孢杆菌，有利于微生物相关生态位的抢占，进而通过菌群竞争抑制真菌的生长（Sanjukta等，2021）。此外，枯草芽孢杆菌的胞外产物对真菌具有抑制效果，能够预防饲料真菌污染。

表3 发酵豆粕真菌毒素与黄曲霉检测

豆粕中芽孢杆菌的分离鉴定结果显示，添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵后的豆粕中，分离到枯草芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌三类芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌是优势菌；未添加菌剂的发酵豆粕中的芽孢杆菌包含贝莱斯芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌广泛存在于环境中，是芽孢杆菌中应用较为广泛的菌种。枯草芽孢杆菌应用于豆粕发酵，能够提高豆粕中的蛋白质含量，更利于肠道吸收率（Pleadin等，2019；Zhang等，2018）。地衣芽孢杆菌能够清除自由基，提高抗氧化能力（Parrado等，2014）。贝莱斯芽孢杆菌能够产生淀粉酶和纤维素酶，在饲料中也有广泛的应用（钟丽娟等，2021）。索诺拉沙漠芽孢杆菌广泛存在于发酵食品，如晒醋、饲粮中，提高食品品质（杨新等，2018）。添加枯草芽孢杆菌发酵，加入的芽孢杆菌优先占据相应的生态位，具有生长优势（Chesson等，2008）。因此，抑制具有相同生态位芽孢杆菌的生长，推测这是导致添加菌剂组芽孢杆菌种类少的原因。而随着发酵进行，发酵豆粕中的微环境改变，进而其他芽孢杆菌进入增殖状态，导致地衣芽孢杆菌成为优势菌。

3 结论

本文筛选获得的耐高温芽孢杆菌，能够抵御饲料发酵产生的高温，产生纤维素酶，促进豆粕中纤维素的降解。耐高温枯草芽孢杆菌FJAT-5561在45℃、pH为8的条件下，其发酵上清液的纤维素酶活性为0.90 U/mL。并且枯草芽孢杆菌FJAT-5561的对青霉具有抑制效果。豆粕发酵试验中，添加FJAT-5561发酵豆粕，发酵后物料中的粗纤维含量（4.2%）低于对照组（4.6%），粗蛋白质含量比对照组高4.2个百分点。发酵后的豆粕中未检出真菌毒素和黄曲霉。本研究中的枯草芽孢杆菌FJAT-5561在豆粕饲料发酵中具有良好的应用潜力。