循环肿瘤细胞和血清肿瘤标志物检测对胃癌腹膜转移的诊断意义

孙利君，陈日红，孙开裕，黄先进，全祯豪，黄超辉，许庆文，林 琳（广东医科大学附属医院胃肠外科，广东湛江 524000）

据国际癌症研究机构（IARC）收集的数据提示，2020 年全世界新增胃癌病例约108.9 万例，2020 年全世界胃癌死亡人数约为76.9 万，且多数患者发现时已为晚期，出现了腹膜转移、肝转移或盆腔转移等，从而错过了手术治疗的最佳时机。目前认为外周血微转移灶与肿瘤发生血行转移密切相关，是肿瘤发生发展的关键因素[1]，且临床上依赖传统的血清学肿瘤指标、影像学检查等存在特异性不足、滞后性等缺点[2-3]，难以早期检测微转移灶。随着精准医学的发展，人们逐渐发现循环肿瘤细胞（CTCs）是恶性肿瘤患者复发、转移的重要影响因素。有文献报道，CTCs 可作为胃癌早期检测的生物标志物，并可提供关于胃癌患者治疗反应和预后的有用信息[4-6]。血清肿瘤标志物是与肿瘤相关的抗原，而非肿瘤的特异性抗原，在一定程度上也能够反映肿瘤的发生和发展，血清肿瘤标志物可以在肿瘤组织、血液和排泄物中检测到。迄今，还没发现一种标志物对胃癌腹膜转移早期诊断有较高的阳性率和特异性，且多数肿瘤标志物在胃癌复发及转移早期敏感度低，说明对于肿瘤腹膜转移的早期诊断具有一定的困难。寻找一种更为简单、快捷、无创的方法来诊断胃癌腹膜转移迫在眉睫，从而为胃癌腹膜转移的早期诊断、治疗方案选择等提供更为可靠的依据，本文对此进行了探究。

1 资料和方法

1.1 病例资料

选取2019-2021 年广东医科大学附属医院胃肠外科收治的无腹膜转移胃癌患者147 例（无腹膜转移胃癌组）及有腹膜转移的胃癌患者40 例（腹膜转移胃癌组）。无腹膜转移胃癌组中男96 例，女51 例，平均年龄63.2 岁；腹膜转移胃癌组中男22 例，女18 例，平均年龄62.7 岁。

1.2 方法

检测患者CTCs 及CEA、CA125、CA199 的表达水平，分析胃癌腹膜转移与临床病理特征的相关性，分析CTCs、CEA、CA125、CA199 单检及联合检测在胃癌腹膜转移中的诊断效能。

1.2.1 CTCs 的检测 采用多重mRNA 原位分析（MRIA）的方法，对CTCs 进行分型和鉴定。在患者术前空腹状态下抽取其外周血10 mL，首先裂解外周血中的红细胞，再根据CTCs 与白细胞的大小差异通过纳米技术进行CTCs 的分离和富集，再对富集的CTCs进行特异性基因核酸定位。根据CanPatrol™ CTCs 检测技术说明书判读标准以及参阅文献，本研究将胃癌患者的外周血中检测的CTCs 数大于或等于2 个定义为CTCs 阳性。

1.2.2 血清肿瘤标志物（CEA、CA125、CA199）的检测 患者血清肿瘤标志物 CEA、CA125、CA199 的标本均在术前空腹状态下抽取外周血，并送广东医科大学附属医院检验科进行定量标记分析。所采集的血样标本离心后加入相应的肿瘤标记盒中进行检测。根据文献数据及肿瘤试剂盒说明，本研究将血清 CEA、CA125、CA199 的临界值分别定为 5 μg/L、35 U/mL、27 U/mL，超过其临界值的定义为阳性。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 26.0 软件进行统计学处理，对各组计量资料进行正态性检验，以描述正态分布的数据，中位数及四分位间距描述非正态分布数据。分类资采用卡方检验。采用独立样本的非参数检验（Mann-Whitney U 检验）进行组间CTCs、CEA、CA125 及CAl99 测量值的比较。CTCs、CEA、CAl25 及CAl99对胃癌腹膜转移的诊断效能比较采用MedCalc 软件进行受试者工作特征曲线（ROC 曲线）分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床及病理学特征的比较

与无腹膜转移胃癌组相比，有腹膜转移胃癌组患者原发病灶的肿瘤更大、分化程度更低、神经及脉管侵犯更多，CTCs、CEA、CA125、CA199 阳性率更高（P＜0.01）；而两组的性别、年龄的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组临床及病理学特征的比较 （例）

续表1

2.2 CTCs、CEA、CA125、CA199 表达水平

腹膜转移胃癌组的CEA、CA125、CA199、CTCs、上皮型CTCs（eCTCs）、间质型CTCs（bCTCs）、混合型CTCs（mCTCs）的水平均高于无腹膜转移胃癌组（P＜0.01 或0.05）。见表2。

表2 CTCs、CEA、CA125 及CA199 表达水平在两组中的差异 [中位数（P25，P75）]

2.3 CTCs、CEA、CA125、CA199 对胃癌腹膜转移的诊断效能分析

根据ROC 曲线，血清CA125 参考值为18.39 U/L时，诊断胃癌腹膜转移的敏感度为62.50%，特异度为88.44%，AUC 值为0.74，95%置信区间为[0.672，0.802]，约登指数为0.509（P＜0.05）。当血清CTCs 参考值为10 个/10 mL 时，诊断胃癌腹膜转移的敏感度为90.00%，特异度为53.06%，AUC 值为0.72，95%置信区间为[0.649 0.783]，约登指数为5.234（P＜0.05）。CTCs、CA125 对于胃癌腹膜转移的诊断效能高于CEA、CA199。见表3，图1。

图1 CTCs、CEA、CA125、CA199 诊断胃癌腹膜转移的ROC 曲线

表3 CTCs、CEA、CA125、CA199 诊断效能的比较

2.4 CTCs、血清CEA、CA125、CA199 联合对胃癌腹膜转移的诊断效能分析

根据ROC 曲线可知，CTCs+CEA+CA125+CA199联合诊断胃癌腹膜转移的 ROC 曲线下面积0.80，敏感性为 65.00%，特异性为87.80%，CTCs+CEA+CA125+CA19 联合起来对于胃癌腹膜转移的诊断准确性较单一诊断时的准确性高。见表4、5，图2。

表4 CTCs、CEA、CA125、CA199 诊断效能的两两比较

图2 CTCs、CEA、CA125、CA199 联合诊断胃癌腹膜转移ROC 曲线

表5 CTCs、CEA、CA125、CA199 联合对胃癌腹膜转移的诊断效能

3 讨论

腹膜转移已成为影响胃癌患者预后的重要因素之一。目前肿瘤腹膜转移常用的诊断手段包括CT、MRI、超声多普勒以及PET-CT、腹腔灌洗液细胞学、诊断性腹腔镜探查[7-8]，但这些均具一定的局限性。腹膜转移的发病机制也十分复杂，可能与肿瘤细胞的粘附、移动、降解、血管生成、免疫逃逸等因素有关。目前公认的发病机制是“种子-土壤学说”[9]。目前已发现大约80% 的转移性肿瘤细胞来源于早期播散的癌细胞[10]。CTCs 的概念是由Ashworth 在1896 年首次提出的[11]，它是指在血液循环中的具有转移潜能及高活力的肿瘤细胞，不仅可形成微转移，而且在一定条件下还可发展为转移癌[12]。Pantel 等[13]的研究表明，在胃癌患者中，外周血中CTCs 的检测可能在监测肿瘤的复发和转移方面有临床价值。一项关于胃癌患者中CTCs 预后意义的meta 分析结果显示CTCs 的检测与胃癌患者的不良预后相关，晚期胃癌中CTCs 的数量高于早期胃癌，低分化胃癌高于高/中分化胃癌，有淋巴结转移的胃癌高于无淋巴结转移的胃癌；它还与患者的无病生存率和总生存率显著相关[14]。也有研究发现CTCs 在胃癌腹膜转移患者中更常见（9/25，36%），而在肝转移患者中较少（1/5，20%）[15]。正常情况下血清中CEA 含量极低，而在食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌患者中CEA 水平呈升高趋势。CAl99 是一种存在于血清中的黏蛋白，有研究发现在胃癌患者中，血清CEA和CA199 水平可被广泛用于预测预后和复发[16-17]。但在Kim 等[18]的研究中，血清CEA 和CA199 诊断腹膜转移的特异性与敏感性却不高，本研究结果基本与其相符。本研究中CEA 诊断胃癌腹膜转移的敏感性和特异性分别为55.00% 和74.15%，CA199 诊断胃癌腹膜转移的敏感性和特异性分别为52.50% 和80.27%。CA125 是一种存在于细胞表面的糖蛋白，能够参与并促进卵巢肿瘤细胞的生长。因CA125 无组织特异性，其升高也见于胃肠道肿瘤、肺部肿瘤等[19]。有研究表明，肿瘤细胞表面膜上的CA125 通过与间皮细胞表面分子间硫蛋白的结合启动细胞与间皮细胞的附着，从而促进腹膜转移的形成[20-21]。也有研究提示血清CA125 表达水平对于胃癌腹膜转移有一定的诊断价值[22-23]。可见，血清CA125 表达水平升高可能不仅仅是疾病进展的结果，可能与腹膜转移的进展也有因果关系。本研究结果显示，腹膜转移胃癌组CEA、CA125、CA199、CTCs 及其分型的平均水平均高于无腹膜转移胃癌组，这与以往研究报道的结果一致，即CTCs、血清肿瘤标志物在肿瘤的复发和转移中有其临床价值。有研究结果提示，CTCs 对胃癌腹膜转移的诊断有一定的诊断意义[24]。在先前有关胃癌CTCs 的研究中，Hiraiwa 等[25]使用了2 个CTCs 作为临界值，本研究也参考他们的做法，使用2 个CTCs 作为临界值。而对于胃癌腹膜转移，本研究通过ROC 曲线分析将临界值确定为10 个CTCs，此时CTCs 对胃癌腹膜转移的灵敏性为90.00%，特异性为53.06%，AUC 为0.72，这与以往的研究结果基本一致。

近年来，大量的研究发现肿瘤标志物在判定肿瘤的疗效、预后等方面有一定的临床价值，还发现肿瘤标志物联合检测可以提高其诊断的准确性。在胃癌腹膜转移的早期诊断中，单一的传统血清肿瘤标志物检测是片面的，采用联合检测的方法很有必要。本研究中，我们对CTCs、CEA、CA125、CA199 单一诊断及CTCs+CEA+CA125+CA199 联合诊断胃癌腹膜转移的AUC 分别为 0.72、0.63、0.74、0.68、0.80。诊断的准确性排序为CTCs+CEA+CA125+CA199＞CA125＞CT Cs＞CA199＞CEA，CTCs+CEA+CA125+CA199 联合诊断的准确性高于CTCs、CEA、CA125、CA199 单一检测。

综上所述，CTCs、血清肿瘤标志物（CEA、CA125、CA199）联合检测可提高诊断胃癌腹膜转移的准确性，对胃癌腹膜转移的早期诊断、病情进展等均有较为重要的临床价值，可成为较可靠的肿瘤评价指标，二者结合可提高临床诊断的准确率。

但需注意的是，本研究也存在以下局限性：（1）CTCs 并不是胃癌腹膜转移的特异性生物标志物，它可以在各种肿瘤中检测到，如结直肠癌、乳腺癌、食管癌，因此CTCs 用于胃癌腹膜转移的诊断仍存在一定局限性，更适合作为胃癌腹膜转移的辅助诊断；（2）本研究并未纳入腹膜转移之外其他远处转移的胃癌患者，对此无法进行直接分析，且纳入的患者均来自同一机构，样本量较小；（3）对于CTCs 临界值的确定，尽管笔者查阅了大量文献，但迄今的相关研究并未确定得到公认的标准，这可能使本研究出现偏倚，需要后续更为深入的研究，例如进行多中心及更大样本的研究，从而进一步确定CTCs 的临界值，以使CTCs 及血清肿瘤标志物在胃癌腹膜转移患者中的临床意义更为明确。