线粒体自噬相关信号通路和蛋白在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究进展

罗苑，段小花，杨丽萍，陈普

1 云南中医药大学民族医药学院，昆明 650500；2 云南省傣医药与彝医药重点实验室

脑卒中分为出血性和缺血性两类，其中近80%的脑卒中为缺血性卒中。溶栓治疗是目前挽救急性脑缺血半暗带神经细胞最有效的治疗策略，可通过再灌注恢复血液供应，挽救缺血组织。但缺血后再灌注常引发多种分子级联反应，如氧化应激、钙离子超载、凋亡基因激活等，加重神经元损伤，导致受损线粒体堆积，最终造成脑缺血再灌注损伤（CIRI）［1］。线粒体是细胞存亡的关键调节因子，一方面通过产生腺苷三磷酸（ATP）来控制细胞生存，另一方面通过释放细胞色素C（Cyt C）等促凋亡因子来控制细胞死亡［2］。CIRI 期间产生大量活性氧和钙离子，造成线粒体通透性转化孔过度开放，引起线粒体通透性改变，膜结构被破坏，发生线粒体膜电位的降低甚至内膜两侧离子梯度消失、线粒体内钙离子超载等级联反应，导致线粒体功能障碍；而线粒体功能障碍又反过来加重脑细胞能量供应障碍、氧化应激损伤、线粒体钙超载。这些病理变化相互影响，互为因果，共同引起Cyt C和凋亡诱导因子等多种凋亡因子释放，最终导致脑细胞坏死和凋亡［3-4］。因此，线粒体功能障碍是CIRI 中的重要环节，同时线粒体功能障碍也会诱导线粒体自噬，通过消除受损或去极化线粒体来维持细胞稳态。线粒体自噬是一个复杂的生理过程，双层膜结构的自噬泡通过信号诱导生成，并不断延伸至包裹待降解的线粒体和部分胞质，形成完整的自噬体，进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，随后由溶酶体释放水解酶，降解其所包裹的内容物，以供细胞循环利用，最终实现细胞稳态和细胞器的更新［5］。研究显示，在CIRI中，多种信号通路和线粒体自噬受体蛋白通过介导线粒体自噬发挥重要作用，因此调节线粒体自噬可能是减轻CIRI、保护脑神经细胞的有前景的治疗策略。现就CIRI 中与线粒体自噬相关的信号通路及关键蛋白综述如下。

1 线粒体自噬相关信号通路对CIRI的调控作用

1.1 PINK1/Parkin/p62 通路 PINK1/Parkin/p62通路参与了膜电位降低引起的线粒体自噬，是自噬最经典的机制通路。研究显示，在CIRI 的神经元中，Parkin 感受线粒体跨膜电位的丢失，并靶向降解受损线粒体［6］。LAN 等［7］报道，大鼠脑缺血再灌注后，严重的细胞损伤导致PINK1 显著聚集于线粒体外膜，进而导致Parkin 和p62 线粒体易位增加，特别是在再灌注后24 h。WU 等［8］报道，体外氧糖剥夺/复氧模型可激活PINK1/Parkin/p62 通路介导的线粒体自噬，抑制脑神经细胞凋亡，发挥脑保护作用。动物实验显示，Parkin 在缺血性中风脑组织中下调，而Parkin基因敲除小鼠在缺血24 h内具有很高的病死率，表明Parkin 在脑缺血再灌注后神经元的存活中具有决定性作用［9］。且PINK1/Parkin/p62 通路介导的线粒体自噬主要发生在神经元中，同时也存在于神经血管单元，包括星形胶质细胞和血管内皮细胞在内的重要组成部分，可共同维持神经元生存和功能的稳态。

我国自主研发的消旋正丁基苯酞，在脑血管疾病治疗领域已被作为神经保护剂广泛应用。研究发现，其改善大鼠CIRI 的作用可能与抑制PINK1/Parkin/p62 通路介导的线粒体自噬有关［10］。在中医方面，现代药理研究表明，多种益气活血类中药的有效成分均可不同程度地调节线粒体自噬。其中从藤黄中提取出的氧杂蒽酮化合物［11］、复方脑肽节苷脂［12］可诱导Parkin 易位至受损线粒体，被PINK1 磷酸化并上调线粒体自噬来抑制CIRI，发挥其神经保护作用。中医外治法方面，有研究表明，电针可以通过PINK1/Parkin/p62 介导的线粒体自噬途径，减少受损线粒体的积累，改善脑缺血再灌注后神经元的损伤［13］。

1.2 MAPK/ERK/CREB 通路 MAPK 丝裂原活化蛋白激酶家族是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，体外氧糖剥夺/复氧和体内CIRI 过程中的自噬受MAPK/ERK1/2通路调控［14］。既往研究显示，MAPK/ERK/CREB 通路是神经炎症和心衰中线粒体吞噬激活的主要调节因子［15］。ZHANG等［16］发 现，阻 断MAPK/ERK/CREB 通 路 可 扰 乱NR4A1 修饰的线粒体自噬，并减少Mfn2 表达，从而促进神经元线粒体凋亡。这表明CIRI 的发生与增加NR4A1、阻断MAPK/ERK/CREB通路导致的保护性线粒体自噬下降密切相关。

1.3 PI3K/Akt/mTOR通路 PI3K/Akt/mTOR信号通路在细胞增殖、凋亡、代谢和血管生成等信号转导和生物学过程中发挥重要作用，而自噬可能是该通路中促细胞生存的一部分。研究发现，在新生儿脑缺血中，自噬或PI3K/Akt/mTOR 通路被阻断时，细胞会发生坏死［17］。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（mTOR）是自噬的负调节因子，在营养条件改变时控制细胞反应，调节多种能量代谢途径；抑制mTOR可降低ATP5O 和TFAM 蛋白水平，影响线粒体质量、mtDNA 含量和细胞ATP 水平［18］。这表明自噬是发育和病理条件下线粒体更替的主要机制。雷帕霉素是mTOR 抑制剂，能与mTOR 特异性结合诱导自噬发生，具有神经保护作用。动物实验显示，雷帕霉素可改善CIRI 大鼠的认知功能障碍，减轻神经元损伤和线粒体功能障碍；其机制是通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路增强线粒体自噬，从而发挥神经保护作用［19-20］。

2 线粒体自噬相关蛋白对CIRI的调控作用

2.1 自噬受体蛋白 目前已经鉴定出哺乳动物细胞里BNIP3、Nix 和FUNDC1 三个自噬受体蛋白，可以直接与微管相关蛋白1轻链3（LC3）相互作用。2.1.1 BNIP3 BNIP3 是一种线粒体膜外蛋白，最早被发现具有促凋亡作用；近年研究表明，BNIP3可以与自噬标记物LC3 直接相互作用，介导线粒体自噬发生。有研究发现，缺乏BNIP3 的幼鼠线粒体自噬减少，导致脑缺血再灌注7 d 后梗死面积明显变小［21］。另有研究表明，BNIP3 诱导缺血再灌注后过度的线粒体自噬，可引发迟发性神经元死亡，最终加重脑损伤。这可能是因为BNIP3蛋白在转录后进行修饰，产生促存活和促凋亡两种相反的功能，使得BNIP3 的功能受到争议。因此，如何阻止促凋亡蛋白如BNIP3等超过“死亡信号”阈值的线粒体自噬平衡，值得我们深入研究。

对中药方剂的研究显示，小续命汤具有活血化瘀、疏通经络的功效，在脑缺血缺氧再灌注后不同时间节点内，通过抑制缺血再灌注后24 h 时线粒体自噬的过度激活，以及促进缺血再灌注后期线粒体自噬，来达到调节线粒体自噬的稳态平衡，对保护脑组织发挥重要作用，并且这一过程由BNIP3 参与调节［9］。

2.1.2 Nix Nix定位于线粒体外膜，与红细胞成熟过程中线粒体的自噬清除关系密切。Nix 是BNIP3的同源体，表达于线粒体和内质网，定位于线粒体外膜，通过LC3 直接与吞噬小体结合［5］。脑组织由于脑血流中断造成的缺血缺氧是CIRI 的首发事件。在缺氧条件下，细胞通过上调BNIP3 和Nix 表达来激活线粒体自噬，从而改善缺血再灌注造成的脑损伤［22］。YUAN 等［23］报道，BNIP3 和Nix 参与了脑缺血再灌注诱导的线粒体自噬，并证明其介导的线粒体自噬有独立于Parkin的作用。

2.1.3 FUNDC1 FUNDC1蛋白是另一种线粒体自噬受体，受到磷酸化调节，通常表现为自噬的抑制状态，因为Src 蛋白激酶能够磷酸化FUNDC1 第18 位的酪氨酸，从而使FUNDC1和LC3的相互作用减弱。然而，在脑缺血缺氧条件下，Src 蛋白激酶的活性被抑制，此时FUNDC1 去磷酸化，使得FUNDC1 和LC3的相互作用增强，开始介导线粒体自噬的发生［24］。在脑缺血低氧的情况下，这两者的结合能力进一步加强，且远强于Nix 与LC3 的结合能力，提示在随后的再灌注损伤中FUNDC1介导的线粒体自噬可能发挥更加重要的作用。

2.2 LC3 结合自噬底物p62 LC3 是哺乳动物细胞中自噬结构的优良标记Atg8 家族的主要同源物，是一个典型的自噬体标记物。Atg8 分为两个主要亚家族，即MAP1LC3/LC3 和GABARAP，其中GABARAP 亚家族成员参与自噬体形成的后期，且PINK1/Parkin信号通路依赖的线粒体自噬必须需要GABARAP 亚家族。p62 作为LC3 和泛素化底物之间的连接物，是一种自噬底物，为多功能的泛素结合蛋白，它通过与LC3相互作用，被整合到完整的自噬小体中，并在自噬溶酶体中降解，因此可作为自噬降解的指标［25］。有研究观察到，雷帕霉素通过增强线粒体自噬来改善大鼠CIRI，这可以通过线粒体中LC3Ⅱ和Beclin-1 表达增加以及p62 易位到线粒体来证明［26］。

2.3 电压依赖的阴离子通道1（VDAC1） VDAC1位于线粒体外膜，是Parkin 聚泛素化的底物。VDAC1 可以促进线粒体自噬并保护脑出血模型中的神经元损伤。研究显示，LC3 与VDAC1 的重叠率可以反映神经元细胞中线粒体自噬的水平［27］。但是，VDAC1 并不能完全代偿泛素化丢失引起的线粒体自噬失常。因此，VDAC1 是否为线粒体自噬必需蛋白仍有待进一步研究。

2.4 Beclin-1 Beclin-1是自噬调节蛋白，其通过招募Vps34、Ambra 蛋白形成自噬小体来激活PI3K/Akt/mTOR 参与线粒体自噬过程。有研究表明，在CIRI 中Beclin-1 水平上调可能激活线粒体自噬，其通过与BNIP3/Nix 和PINK1 相互结合，在线粒体自噬中发挥作用［28］。白藜芦醇（Res）是一种非黄酮类多酚化合物，广泛存在于葡萄、虎杖等天然植物中。在CIRI 大鼠中，Res 可通过增加Beclin-1 水平促进LC3Ⅱ募集，并通过减少LAMP1 降低线粒体基质蛋白HSP60 水平，从而促进线粒体自噬，消除受损的线粒体，增加ATP来源［29］。

2.5 线粒体融合与分裂蛋白 线粒体分裂与线粒体融合这两个过程共同构成了线粒体动力学。在神经元中，受损线粒体可通过与健康线粒体融合来修复，也可以通过线粒体分裂，分离受损线粒体后由线粒体自噬来消除，以保持动态平衡，达到线粒体的稳态。在缺血和CIRI 时线粒体会过度分裂或碎裂。动态相关蛋白1（Drp1）是线粒体裂变的主要介质，可以加速线粒体分裂，产生大量片段化的线粒体。线粒体融合主要受三磷酸鸟苷（GTP）酶Opa1、Mfn1、Mfn2 的影响，主要维持线粒体嵴的正常形态。DUAN 等［30］在小鼠脑缺血损伤中发现，Drp1 活化后可以通过Clec16a抑制Parkin 的线粒体转位，对线粒体自噬通路有重要调节作用。动物实验显示，NR4A1通过破坏Mfn2介导的自噬作用，导致小鼠脑缺血再灌注后的线粒体损伤［16］。在脑缺血损伤早期，塞络通胶囊可通过抑制缺血再灌注后Drp1 的升高来减轻线粒体分裂异常，促进线粒体融合基因Opa1 的表达进而恢复线粒体的形态，减轻CIRI［31］。因而，线粒体融合分裂相关蛋白与线粒体自噬有着不可分割性。

综上所述，线粒体自噬是维持细胞内稳态的重要细胞途径，适当的线粒体自噬有助于保护神经细胞，而线粒体自噬不足或过度是有害的，会导致神经细胞死亡，加重脑损伤。因此，调控脑缺血再灌注后线粒体自噬的信号通路及关键指标是保护神经细胞、治疗CIRI 的关键靶点。在CIRI 过程中，多种信号通路以及关键蛋白参与了线粒体自噬的发生和调控。基于线粒体自噬在CIRI 中的关键作用，我们可以从调控线粒体自噬的发生机制、脑缺血再灌注阶段自噬关键指标以及多种信号途径的病理转归方面入手，深入研究线粒体自噬在脑缺血再灌注后的动态过程，对线粒体自噬进行适当的靶向调节，发挥保护神经细胞的作用，从而阻断CIRI的恶性循环。