益母草碱、黄精多糖、脱氧野尻霉素联合用药抗血栓和降血糖疗效的评价

王子丽，许舒雯，边金焕，赵 辉，龚祝南，

(1. 南京师范大学食品与制药工程学院，江苏 南京 210046；2. 安徽省科学技术研究院，安徽 合肥 230088；3. 南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046)

研究证实，糖尿病患者血浆中4项凝血纤溶指标含量明显高于非糖尿病患者[1]，体内高胰岛素血症、高血糖、胰岛素抵抗这些因素可以导致糖尿病患者的内皮细胞结构和功能比正常人更容易受到损伤[2-3]，使得糖尿病患者更容易诱发血栓形成[4]。血栓形成后可诱发并加重糖尿病的其他并发症，因此，了解并针对糖尿病血栓并发症的发病机制，采取适当的防治措施，可减缓糖尿病血栓并发症的发展[5]，提高糖尿病患者的生存质量。目前，已知的抗血栓药物不良反应较多[6]，中药在血栓治疗历程中具有重要的地位[7]，活血化瘀是中医抗血栓的黄金治则。益母草中活性成分益母草碱(leonurine，SCM)的活血化瘀功效，及其在抗糖尿病和血栓方面的治疗效果，已经得到充分验证[8-9]；黄精的主要成分黄精多糖(polygonatum polysaccharide，PSP)具有降血糖、调血脂的作用[10]；脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin，DNJ)也已被证实可有效降低血糖[11]。这3者的联合使用在治疗Ⅱ型糖尿病和血栓方面的疗效及其作用机制，是我们这项研究的主要目的。

斑马鱼拥有70%的人类同源基因，且含有凝血因子、血小板受体，对临床应用的抗凝血和抗血栓药物具有很好的反映，使其成为广泛研究人类疾病的新型动物模型[12]。本文在建立糖尿病模型的基础上，利用苯肼(phenyl hydrazine，PH)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、普纳替尼(ponatinib，PT)3种不同诱导剂建立不同机制的斑马鱼糖尿病合并血栓模型，研究SCM、PSP、DNJ联合用药抗血栓、降血糖的效果和作用机制，为下一步药物开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物斑马鱼(AB系野生型)购自杭州环特生物科技股份有限公司(生产许可证号SCXK(浙)2021-0003)。

1.2 药品与试剂SCM(批号AGW576)、PSP(批号20191113)、DNJ(批号F20245)由安徽省科学技术研究院提供。链脲佐菌素(streptozocin，STZ，批号20191022)购自广州赛国生物科技有限公司；盐酸二甲双胍(metformin，Met，批号c10619732)购自上海麦克林生化科技有限公司；苯肼(批号G2030006)、花生四烯酸(批号A111764)、普纳替尼(批号F1511088)、阿司匹林(aspirin，ASP，批号H2017089)、邻联茴香胺(批号C2009167)、无水醋酸钠(批号2004091)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%过氧化氢(批号ZCD150)购自广州检测科技有限公司；肌球蛋白轻链激酶亚型(myosin light chain kinase，Mlck1a)、蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha，PKCα)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)、β-actin(批号2313111474)引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR，批号7E531L1)试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；QuantiChromTMGlucose Assay Kit葡萄糖测试盒(批号DIGL-100)购自北京群晓科苑生物技术有限公司。

1.3 仪器恒温光照培养箱(宁波东南仪器有限公司)；IM-9B型手动斑马鱼显微注射泵(日本 Narishige公司)；酶标仪(美国BIO-TEK ELx808)；PCR仪(美国ABI 2720 Step One Plus)；超微量分光光度计(美国Nano drop，ND-1000)；qRT-PCR仪(瑞士Roche公司)；EVOS新型显微镜细胞成像系统(美国Life Technologies公司)。

1.4 方法

1.4.1药物对斑马鱼早期发育毒性的影响 挑选受精24 h后发育正常的斑马鱼胚胎，每孔6颗放入24孔板，每个药物设置6个浓度梯度，每个浓度设置3个平行复孔，另设一孔观察毒性对于斑马鱼形态的影响。空白对照组暴露在胚胎培养基中，实验组暴露于不同浓度的Met+ASP、SCM、PSP、DNJ中。置于28 ℃恒温光照培养箱中，统计并记录暴露后24、48、72、96、120 h时斑马鱼胚胎死亡、孵化情况，在受精后6 d(days post fertilization，dpf)计算各药物对斑马鱼半数致死浓度(lethal concentration 50 %，LC50)。4 dpf通过EVOS新型显微镜细胞成像系统观察斑马鱼给药后的形态变化。

1.4.2苯肼、花生四烯酸、普纳替尼诱导三种糖尿病斑马鱼血栓模型的建立及药物干预 选择2 dpf的斑马鱼胚胎显微注射构建Ⅱ型糖尿病模型[13 - 14]。用0.1 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素配成200 mg·L-1溶液，把斑马鱼胚胎放置在琼脂糖凝胶板的凹槽内，每尾斑马鱼幼鱼注射的体积约是2 nL，注射完成的胚胎立即放回培养基，后放入培养箱，每隔8 h观察，移除脱下的卵黄膜，培养至建立血栓模型。

3 dpf的斑马鱼血小板含量丰富，因此选择3 dpf的斑马鱼用于PH、AA模型构建，5 dpf的斑马鱼内皮细胞生长完整，选择5 dpf的斑马鱼用于PT模型构建。注射STZ后的健康斑马鱼胚胎，分别在3 dpf和5 dpf分到24孔板中，设置对照组(Control)、模型组(1 μmol·L-1PH处理制备PH model，80 μmol·L-1AA处理制备AA model，5 mg·L-1PT处理制备PT model)、阳性药组(Met+ASP)、联合药物高、中、低浓度干预组，3个模型实验各设6个实验组，每组60～70尾。对照组用培养基培养，PH和AA的给药组用对应浓度的药液预处理6 h[15]，后将模型组替换为造模剂，给药组替换为含造模剂与对应浓度药液的培养液，在28 ℃恒温培养箱继续培养(PH 24 h，AA 1.5 h，PT 18 h)，取5尾用于尾静脉和心脏红细胞染色观察，取30尾用于斑马鱼总RNA提取，25尾用于斑马鱼组织糖含量测定。

1.4.3邻联茴香胺染色 移除24孔板中培养液，吸取同体积的邻联茴香胺染色液3 mL，锡箔纸避光染色，置于28 ℃恒温培养箱中，黑暗孵育10～15 min，取出微孔板，快速吸干染色液，用二甲基亚砜快速清洗3遍，将斑马鱼转到新的24孔板中，加入等体积二甲基亚砜。吸出斑马鱼侧位放置于载玻片上，置于显微镜下对心脏及尾静脉观察并拍照，用Image-Pro Plus统计斑马鱼心脏染色强度(staining intensity，SI)，进行定量分析。

抑制血栓率/%=[SI(药物干预组)-SI(模型组)]/[SI(正常对照组)-SI(模型组)]×100 %。

1.4.4qRT-PCR检测血栓相关基因mRNA表达 对照组、模型组、阳性药组和联合药物高中低浓度干预组分别选取25尾斑马鱼幼鱼，按照试剂盒说明书提取斑马鱼组织总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析，引物序列见Tab 1。

Tab 1 qRT-PCR primer sequences

1.4.5幼鱼的组织糖含量测定 将斑马鱼吸取到离心管中，吸干培养液，加入200 μL磷酸盐缓冲液充分研磨，12 000 r·min-1，4 ℃，离心10 min，按QuantiChromTMGlucose Assay Kit葡萄糖试剂盒方法进行测定。

2 结果

2.1 阳性药物和各给药组对斑马鱼死亡率的影响如Fig1所示，Met+ASP组随着给药浓度增加，死亡率增高(Fig 1A)；SCM与PSP毒性相当，当SCM浓度高于400 mg·L-1时，6 dpf斑马鱼死亡率接近100%，LC50值为317.4 mg·L-1(Fig 1B)；当PSP浓度达到400 mg·L-1时，6 dpf斑马鱼死亡率高于77.78%，LC50值为300.6 mg·L-1(Fig 1C)；DNJ的毒性相比较小，只有高浓度组达到100%，且1 g·L-1DNJ对斑马鱼的毒性非常小，在3 dpf时斑马鱼死亡率仅为5.56%，之后实验周期内保持不变(Fig 1D)。

Fig 1 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on zebrafish mortalityA：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ

2.2 阳性药物和各给药组对斑马鱼孵化率的影响孵化不仅是斑马鱼胚胎发育的重要阶段，也是评估化学物质对鱼类作用的一个主要毒理学重点。孵化是生理、生化和渗透机制共同作用的结果，斑马鱼胚胎一般从受精后48 h(hours post fertilization，hpf)开始孵化，大多数胚胎在72 hpf孵化，在96 hpf孵育几乎完成。从图中可以看出各种药物在48 hpf孵化率在50%左右，随着时间增长，孵化率增加。与空白组相比，无论暴露在哪种药物中，高剂量给药组的斑马鱼胚胎的孵化被延迟且孵化率达不到100 %，而较低剂量给药组能够促进胚胎孵化(Fig 2)。

Fig 2 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on hatching rate of embryos A：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ.

2.3 阳性药物和各给药组对斑马鱼发育过程中形态变化的影响药物对斑马鱼的毒性主要表现在卵黄囊水肿、脊柱和尾巴弯曲、心包水肿。Met+ASP随着给药浓度增高，卵黄囊肿变大(Fig 3A)；当SCM高于300 mg·L-1时，随着浓度的增大斑马鱼卵黄囊水肿越来越明显，且出现心包水肿、脊柱弯曲、色素沉着的现象(Fig 3B)；PSP低浓度组卵黄囊未见明显变化，浓度高于320 mg·L-1时，明显出现脊椎弯曲、卵黄囊肿等现象(Fig 3C)；低浓度DNJ对斑马鱼的毒性较小，仅有卵黄囊变黑现象，斑马鱼卵黄囊肿大、心包水肿在高浓度组时表现得明显(Fig 3D)。

Fig 3 Effects of Met+ASP，SCM，PSP，DNJ on toxicity of juvenile zebrafishA：Met+ASP; B：SCM：C：PSP; D：DNJ.

综合考虑死亡率、孵化率以及形态特征变化，确定阳性药组(Met 200 mg·L-1+ASP 10 mg·L-1)以及联合药物高浓度组(SCM 150 mg·L-1，PSP 80 mg·L-1，DNJ 1 g·L-1)、中浓度组(SCM 75 mg·L-1，PSP 40 mg·L-11，DNJ 500 mg·L-1)、低浓度组(SCM 37.5 mg·L-1，PSP 20 mg·L-1，DNJ 250 mg·L-1)的给药浓度。

2.4 联合用药对苯肼诱发糖尿病斑马鱼血栓模型的影响苯肼是强氧化剂，通过促进血小板黏附，造成血栓的形成。如Fig 4所示，与对照组比，PH模型组尾静脉血栓明显增加，心脏红细胞染色强度较少(P<0.01)，说明建模成功。与PH模型组比，阳性药(Met+ASP)干预后尾静脉血栓减少明显，心脏红细胞染色强度明显增加(P<0.01)，抑制血栓效率达68.38%；低浓度组尾静脉血栓较多，心脏红细胞染色强度较模型组增加(P<0.01)，抑制血栓率为19.46%；中浓度组尾静脉形成量较模型组减少，心脏红细胞染色强度增加(P<0.01)，抑制血栓率为32.23%；高浓度组尾静脉形成量较模型组明显减少，心脏红细胞染色强度明显增加(P<0.01)，抑制血栓效率达51.23%。各剂量组抑制血栓效率，表现出剂量相关性。

Fig 4 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in phenylhydrazine model

2.5 联合用药对花生四烯酸诱发糖尿病斑马鱼血栓模型的影响花生四烯酸通过激活血小板聚集，调节血管收缩，造成血栓。如Fig 5所示，与对照组比，AA模型组尾静脉血栓明显增加，而心脏红细胞染色强度明显减少(P<0.01)，说明建模成功；与AA模型组比，阳性药(Met+ASP)干预后明显可见尾静脉血栓减少，心脏红细胞染色强度明显增加(P<0.01)，抑制血栓效率达62.01%；低浓度组尾静脉血栓较多，心脏红细胞染色强度与模型组相比(P<0.01)，抑制血栓率为25.03%；中浓度组尾静脉形成量较模型组相比减少不明显，心脏红细胞染色强度(P<0.01)，抑制血栓率为33.58%；高浓度组血栓尾静脉形成量较模型组明显减少，心脏红细胞染色强度明显增加(P<0.01)，抑制血栓效率达46.12%。各剂量组的抑制血栓效率，表现出剂量相关性。

Fig 5 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in the arachidonic acid model

2.6 联合用药对普纳替尼诱发糖尿病斑马鱼血栓模型的影响普纳替尼通过调节某些通路表达诱导血栓形成。如Fig 6所示，与对照组比，PT模型组尾静脉血栓增加非常明显，而心脏红细胞染色强度明显减少(P<0.01)，说明建模成功；与PT模型组比，阳性药(Met+ASP)干预后尾静脉血栓减少明显，仅有较少的血栓且被斑马鱼自身黑色素遮挡，心脏红细胞染色强度明显增加(P<0.01)，抑制血栓效率达69.36%；低浓度组尾静脉血栓较多，心脏红细胞染色强度(P=0.398)，抑制血栓率仅有5.38 %；中浓度组尾静脉形成量较模型组虽然有减少，但不明显，心脏红细胞染色强度(P<0.01)，抑制血栓率为29.68%；高浓度组血栓尾静脉形成量较模型组明显减少，呈现不连续血流，心脏红细胞染色强度明显增加(P<0.01)，抑制血栓效率达48.50%。各剂量组的抑制血栓效率，表现出剂量相关性。

Fig 6 Venous thrombus and cardiac erythrocyte staining in zebrafish after drug intervention in ponatinib model

2.7 联合用药对斑马鱼体内血栓相关转录因子mRNA表达的影响Mlck1a基因能够改变血小板形态和血栓的形成[16]，血管性血友病因子vWF可与胶原及血小板膜GPⅡb/Ⅲa结合，在血小板聚集、黏附过程中发挥重要作用[17]，PKCα已经被证实是血小板功能的重要正调节剂和体内体外血栓形成的关键调节因子[18]。如Fig 7所示，与对照组相比，模型组中Mlck1a、PKCα、vWF mRNA表达水平显著升高；与模型组相比，联合药组基因表达明显下降，且随着给药浓度递增呈现降低的趋势，因此联合药各个浓度都能下调PH、AA、PT诱导的Ⅱ型糖尿病合并血栓模型中Mlck1a、PKCα、vWF基因的表达量，且呈现剂量相关性。

Fig 7 Effect of compound drugs on expression of Mlck1a，PKCα and vWF genes in zebrafish PH model，AA model and PT model

2.8 联合药对斑马鱼组织糖含量的影响基于本实验室前期工作，斑马鱼注射STZ后达到糖尿病状态，且在我们实验周期内，该模型较稳定。如Fig 8所示，联合药3种浓度均可降低3种模型的组织糖含量，每个浓度之间降低组织糖含量的效果差距不大。

Fig 8 Effects of compound drugs on tissue glucose content in zebrafish PH model，AA model and PT model

3 讨论

本文首先通过斑马鱼胚胎发育的毒性研究，确定联合药中各组分的安全给药剂量，使用PH、AA、PT诱导方法建立3种斑马鱼Ⅱ型糖尿病合并血栓模型，可直观的观察血栓形成情况。

对3种模型进行药物干预后，实验显示联合药可有效对抗斑马鱼的血栓形成，说明其可能通过抑制血小板聚集、影响花生四烯酸代谢途径、保护血管内皮等方式，影响血栓的形成。此外，通过qRT-PCR检测血栓相关基因Mlck1a、PKC、vWF mRNA的表达，显示不同浓度的联合药都能不同程度的降低基因的表达，从而影响血小板的形成，进一步降低血栓产生的可能性。

由此可见，本研究通过建立和使用斑马鱼Ⅱ型糖尿病合并血栓模型，证实由SCM、PSP、DNJ组成的联合药物具有抗血栓、降血糖作用，且其抗血栓机制存在多靶点效应，为下一步药物开发提供了理论依据。