浙贝母黑斑病病原菌生物学特性研究

何晓婵,李 玲,周小军,龙安琪,李 强,路子琪,朱丽燕*

(1.金华市农业科学研究院，浙江金华 321000；2.浙江农林大学，浙江临安 311300 )

浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)又称大贝、元宝贝、象贝，是百合科多年生草本植物，为常用大宗中药材和“浙八味”之一，在浙江、江西、湖南等省份均有大面积栽培[1]。浙江的主产区主要包括鄞州、磐安、缙云等地，种植面积约3 670 hm2，占全国的90%以上，是当地农民的主要收入来源[2-4]。

近年来，随着种植面积的不断扩大，加上药农盲目引种，导致浙贝母病害日益突出且呈现多样化，严重影响了浙贝母的产量和质量[5-7]。其中黑斑病是浙贝母的重要病害之一，在田间常与灰霉病混合发生，主要危害叶片，叶片感病后从叶尖开始发病，叶色变淡，呈水渍状褐色病斑，病部与健部有明显的界限，接近健部有晕圈。此病由真菌半知菌亚门交链孢菌(Alternariaalternate(Friss.) Keissler)侵染所致[8]。在浙江常年于3月下旬开始发病，直至植株地上部分枯死。如遇清明节前后春雨连绵，病害则会加重。一般多雨年份有利于该病害的发生[6]。

关于浙贝母黑斑病的发生、防治已有少量报道，但对其病原菌生物学特性研究未见相关文献。笔者对浙贝母黑斑病病原菌生物学特性进行了系统性研究，以期为病害深入研究及其防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料2020年3月，浙贝母黑斑病样本采自浙江省金华市农业科学研究院基地，供试菌株由浙贝母黑斑病样本中分离纯化获得，并经浙江农林大学真菌-植物互作实验室准确鉴定并保存。在试验前，转移到直径为90 mm的PDA培养基平板中间，20 ℃活化培养得到试验用菌株。

1.2 试验方法

1.2.1生长测定。将直径5 mm 的浙贝母黑斑病病原菌菌饼接种于 PDA 平板中央，置于特定条件下培养，数天后采用十字交叉法测量菌落直径，设6次重复，取平均值。

1.2.2不同光照对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响。共设完全光照(光照∶黑暗=24 L∶0 D)、光暗交替(光照∶黑暗=12 L∶12 D)和完全黑暗(光照∶黑暗=0 ∶24 D)3个处理，在PDA培养基上接入直径5 mm的菌丝块，每个处理6次重复，分别置于不同光照条件下培养，测定方法同“1.2.1”。

1.2.3不同温度对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响。将直径5 mm的供试菌株菌丝块接种于PDA平板上，分别置于7、22、25、28、30和33 ℃条件下培养，每个处理设6次重复。测定方法同“1.2.1”。

1.2.4不同pH对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响。将配制好未添加琼脂的PDA培养基分装到10个三角瓶中，每瓶量取150 mL，用1 mmol/L HCl和5 mmol/L NaOH将其pH分别调成4、5、6、7、8、9、10、11，按50∶1的比例加入琼脂。再放至灭菌锅中高温高压灭菌，将灭菌后的培养基倒板，每个处理设6次重复。将直径5 mm的菌丝块接入到上述倒好的平板中，置于26 ℃条件下培养，测定方法同“1.2.1”。

1.2.5不同碳氮源对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响。基础培养基为Czapek，其碳源为蔗糖，1 L Czapek培养基中含30 g蔗糖，以等重量的果糖、木糖、葡萄糖、纤维素、麦芽糖、甘露醇、可溶性淀粉分别置换基础培养基中的蔗糖，以制备不同碳源的培养基。以等重量的甘氨酸、牛肉浸膏、胰蛋白胨、硫酸铵、尿素、氯化铵、脯氨酸分别置换基础培养基中的硝酸钠，以制备不同氮源的培养基。将配制好的培养基高温高压灭菌后，倒平板，每个处理设6次重复，将直径5 mm的菌丝块接入到上述倒好的平板中，置于26 ℃下培养。测定方法同“1.2.1”。

2 结果与分析

2.1 不同光照对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响光照对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响见图1。由图1可知，在12 h光暗交替处理、24 h连续黑暗、24 h连续光照条件下的菌落直径分别为6.90、6.31、7.08 cm，则按照直径从小到大表现为全黑暗<12 h光暗交替处理<全光照，由此可知，全光照处理的菌落直径显著大于黑暗处理，12 h光暗交替处理与24 h连续黑暗、24 h连续光照差异不显著(图2)。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)图1 不同光照对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.1 Effects of different photoperiods on mycelium growth of Alternaria alternate(Friss.) Keissler

图2 不同光照对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响(正、反)Fig.2 Effects of different photoperiods on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

2.2 不同温度对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响温度对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响见图3。由图3可知，温度对病原菌菌丝生长有显著影响。浙贝母黑斑病病菌对温度的适应范围较广，病原菌菌丝在7～33 ℃条件下均能生长。在22～30 ℃条件下，病原菌菌丝生长良好。该菌落的最适生长温度为25 ℃，其次为28 ℃，平均菌落直径分别为5.17和4.87 cm，当温度高于30 ℃时，菌落生长速率明显下降(图4)。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)图3 不同温度对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.3 Effects of different temperatures on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

图4 不同温度对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.4 Effects of different temperatures on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

2.3 不同pH对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响由图5可知，浙贝母黑斑病病菌对酸碱度适应范围较广，病原菌在pH 4～11时均能生长。在相同的培养时间内，pH为7时该菌的菌落直径最大，为4.80 cm，显著高于其他pH处理，表明该菌生长的最适pH为7。随着pH的升高，菌落直径逐渐下降。当pH为11时，菌落直径最小，为3.23 cm(图6)。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)图5 不同pH对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.5 Effects of different pH on mycelium growth of Alternaria alternate(Friss.) Keissler

图6 不同pH对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.6 Effects of different pH on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

2.4 不同碳氮源对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响浙贝母黑斑病病菌可利用多种碳、氮源。但在供试碳源中，可溶性淀粉作为碳源的基础培养基最适合病原菌菌丝的生长，其菌落直径为3.82 cm，显著高于其他碳源培养基上的菌落直径，其次为甘露醇、葡萄糖、果糖；再次为蔗糖、木糖；该菌株在以纤维素为碳源的基础培养基上生长最差(图7～8)。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)图7 不同碳源对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.7 Effects of carbon source on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

图8 不同碳源对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.8 Effects of carbon source on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

在不同氮源处理中，病原菌菌丝在胰蛋白胨培养基上生长最快，菌落直径为4.38 cm，显著高于其他氮源培养基上的菌落直径，其次为牛肉浸膏、硝酸钠、脯氨酸、硫酸铵、甘氨酸、氯化铵，而在以尿素为氮源的基础培养基中生长最慢(图9～10)。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Note:Different lowercase letters indicated significant difference(P<0.05);different capital letters showed extremely significant difference(P<0.01)图9 不同氮源对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.9 Effects of nitrogen source on mycelium growth of Alternaria alternate (Friss.) Keissler

图10 不同氮源对浙贝母黑斑病病原菌菌丝生长的影响Fig.10 Effects of nitrogen source on mycelium growth of Alternaria alternate(Friss.) Keissler

3 讨论

病原菌生物学特性是病害早期诊断、预测与防治的基础[9-10]。浙贝母黑斑病病原菌交链孢菌(Alternariaalternate(Friss.) Keissler)的生物学特性目前国内外未见报道。该试验结果表明，浙贝母黑斑病病原菌菌丝在7～33℃条件下均能生长，该菌的最适生长温度为25 ℃，这与金华当地黑斑病发病规律相吻合。3月温度较低、雨水较多、湿度较大，越冬病原菌开始活跃，随着温度升高病害迅速扩展蔓延至高峰。即温湿度是影响该病害发生和流行的主要因素。病原菌在pH 4～11时均能生长，以pH 7最适，说明该病原菌喜好中性环境。在光照：黑暗=24：0条件下菌丝生长最快；最适菌落生长碳源为可溶性淀粉，最适氮源为胰蛋白胨。

该试验对浙江省金华市磐安县浙贝母黑斑病病原菌进行分离鉴定，对贝母黑斑病病原菌的生物学特性进行研究，试验结果有利于植物病害的预报预警，为有效预防浙贝母黑斑病提供有力的技术支撑。