α5-GABAA受体对认知功能的调节作用及其在突触内外分布双锚靠机制研究进展

王准，尹毅青

天津医科大学肿瘤医院麻醉科 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市“肿瘤防治”重点实验室 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指手术后新出现的学习和记忆等能力下降的神经系统并发症，发病率可因手术类型以及患者的情况而有所差异，老年人的发病率要明显高于青年人［1］。尽管已经受到越来越多人的关注，但是由于大脑的学习和记忆过程的复杂性以及影响因素的混杂性，POCD 的发病机制仍不明确。在学习和记忆的形成过程中，突触可塑性一直被认为起到关键性作用［2］，在抑制性突触的作用下，兴奋性突触的可塑性可以发生改变，而影响大脑的学习和记忆能力。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，通过与GABA 受体结合而起到调节神经信号传递的作用。目前已经发现的GABA 受体主要分为GABAA受体、GABAB受体和GABAC受体三类。含有α5 亚单位的GABAA受体被称为α5-GABAA受体，它不仅可以为多种麻醉药物提供作用位点从而产生麻醉效应，而且还在突触内外的锚靠蛋白作用下参与突触可塑性的调节，因此该受体类型有可能是POCD 发生过程中的关键位点，而且随着研究的深入，其在学习和记忆过程中的重要作用也逐渐被发掘［3-6］。现将α5-GABAA受体对认知功能的调节作用及其在突触内外分布的双锚靠机制研究进展综述如下，为临床探究预防和治疗POCD 提供新的思路。

1 α5-GABAA受体的结构及其在突触内外的分布

1.1 α5-GABAA受体的结构 在GABA 的三种类型受体中，GABAA受体是由同源亚单位构成的异五聚体，从而形成配体门控的氯离子通道受体，通过与配体结合，该类受体可以发挥离子通道的作用允许氯离子通过，从而产生快速的抑制性应答。GABAA受体的每种亚单位均具备相同的结构，包括一个较大的N 末端结构域、一个较小的C 末端结构域和四个跨膜区域（transmembrane，TM）1～4。在TM3与TM4之间形成的胞内结构域（intracellular domain，ICD）是多种形式的翻译后修饰（post-translation modification，PTM）的重要位点，同时也是细胞内蛋白与受体结合的作用位点，在调节受体的定位中起到非常重要的作用。迄今为止，人们在GABAA受体中一共发现了八大类共计19种亚单位，分别为：α1～6、β1～3、γ1～3、θ、δ、ε、π、ρ1～3［6］。而α5-GABAA受体则是指包含有α5 亚单位的GABAA受体类型。不同亚单位装配成的受体可以发挥不同的功能，比如α5/γ2结合后可以为苯二氮卓类药物提供作用位点。随着电子显微镜等新技术的应用［7-8］，对于受体的构成及相关药物作用位点等问题可以更好地被进一步研究和解决。

1.2 α5-GABAA受体在突触内外的分布 α5-GABAA受体在大脑中表达量不多，仅占脑内全部受体的5%，但是在海马区，这一比例可上升至25%，并且较多分布在海马区的CA1和CA3区域［9］。在大脑的其他区域虽然也有α5-GABAA受体的分布，如大脑皮质、杏仁核、下丘脑等，但是这些区域受体的表达水平都较低［10］。随着进一步的研究发现，构成GABAA受体的亚单位不同，不仅影响着受体在组织上的空间定位，而且还影响受体在更细微的亚细胞水平的分布。GABAA受体在细胞膜上的分布可以分为突触内分布和突触外分布，其中含有α1、α2和α3亚单位的GABAA受体主要分布在突触内，由于对GABA的亲和力低，因此介导快速而短暂的phasic 抑制。而突触外含有α4 和/或α6 亚单位的GABAA受体对GABA 具有更强的亲和力，可以介导缓慢但持久的tonic 抑制［10-11］。初始人们认为α5-GABAA受体主要定位在突触外，并在海马中产生tonic 抑制而发挥作用。但近些年的研究则发现，α5-GABAA受体在突触内也有一定分布。通过分布位点不同，α5-GABAA受体可同时发挥phasic 抑制和tonic 抑制两种作用［9］。对于受体来说，其位置的分布并非一成不变，而是一个动态调节的过程。受体可在细胞内合成并被分泌至细胞膜，并在受体的合成分泌过程中受到多种受体相关蛋白的调节。在内质网中，不同类型的亚单位被装配组合成GABA 受体，成功合成的GABAA受体则被运输到高尔基体。通过与Plic-1 的结合，在内质网中的受体亚基会停留一定时间，从而使得未组装的受体亚单位有足够的时间发生多泛素化而被降解。当受体被转运至高尔基体内后，受体会与GABARAP/NSF 复合物结合，进一步促进其向质膜转运［12］。但是有研究发现，α5-GABAA受体在突触内外的分布并不固定，通过受体在质膜上的移动，即横向扩散作用，可以实现受体在突触内外表达的再分布［13-14］。

2 α5-GABAA受体对认知功能的调节作用

大脑的海马区一直被认为是与学习和记忆密切相关的脑区，而α5-GABAA受体在海马区大量分布的特点，使得人们将该受体与学习记忆联系在一起［14］。随着研究的深入，的确发现α5-GABAA受体的改变可以影响实验动物的学习记忆能力。在部分敲低海马区α5-GABAA受体的小鼠中可以发现，小鼠在一些海马依赖的行为如在痕迹条件恐惧试验、新事物识别试验中会发生改变，通过影响SST +/α 5-GABAA受体这一通路来改变受体的表达后，老年动物模型的认知功能发生了明显的改善［15-16］。这些研究都表明，α5-GABAA受体在学习和记忆的过程中确实发挥着关键性作用。但是α5-GABAA受体功能的调节具有双向性。作为α5-GABAA受体的竞争性拮抗剂，S44819 可以使小鼠的空间学习能力和记忆能力可以得到明显的改善［17］。而在前期实验中我们发现，L-655，708 虽然是α5-GABAA受体的反向激动剂，但是却并不总能够改善实验小鼠的认知能力，而是表现出一种年龄相关性：在青年小鼠异氟醚麻醉前和麻醉后应用L-655，708 均可改善小鼠的空间学习和记忆能力，但是对于老年小鼠来说，仅在麻醉前给予L-655，708 有改善认知的作用，麻醉后再给予L-655，708 则对于小鼠的学习和记忆能力不会产生明显的影响［18］。近些年来，在老年动物如阿尔兹海默症小鼠模型中发现，通过正向激动α5-GABAA受体，实验动物的认知能力也可得以提高［19］。激动或者拮抗α5-GABAA受体的功能均可能改善实验动物的认知功能。

3 调节α5-GABAA受体在突触内外分布的双锚靠机制

兴奋性突触的可塑性如长时程增强（long-term potential，LTP）一直被认为是在哺乳动物大脑中进行学习和形成记忆的机制，通过调整突触可塑性可以改变动物的学习记忆能力［20］。但是LTP是一个正反馈过程，兴奋性信号传递至突触后部位发生去极化后刺激机体产生兴奋活动，从而再次出现兴奋性信号，进一步诱导下一次LTP 的产生。因此在此过程中，抑制性突触可以通过其抑制作用避免LTP 的累积，在改变抑制性突触的强度后，LTP 的发生可以被影响和改变［21］。由于突触内外受体产生抑制的性质上的差异，tonic 抑制和phasic 抑制对兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potential，EPSP）改变的程度也有所差异［22］，因此对LTP 的抑制程度也有不同。最新研究发现，在刺激诱发LTP 产生的过程中，突触外的α5-GABAA受体可以进入抑制性突触，并对兴奋性突触反应进行抑制，进而影响动物的反向学习能力［14］。先前也有研究［23］报道，通过横向扩散作用，突触外α5-GABAA受体进入突触后可以使动物的学习记忆能力发生改变。因此，在学习和记忆产生的过程中，除α5-GABAA受体的表达量及总体功能之外，其在突触内外分布的调节可能是发挥其影响认知功能的更为关键的机制。α5-GABAA受体在质膜表达时存在不定向的流动性，使得受体在突触内外均有分布具备了条件基础，不同分布的GABAA受体可以分别产生不同的抑制电流来干扰突触可塑性，进而可以影响学习和记忆的形成。目前认为，在突触外主要依靠radixin蛋白将α5-GABAA受体锚靠在质膜上，从而降低受体的流动性［23-24］，而在突触内，α5-GABAA受体聚集则主要归功于gephyrin 蛋白［14］。这种在突触内外分别由不同的锚靠蛋白对α5-GABAA受体的分布进行调节的机制，我们称之为双锚靠机制。

3.1 锚靠蛋白radixin 在突触外对α5-GABAA受体的锚靠作用及其调控机制 Radixin 是ERM（ezrin，radixin，meosin）蛋白家族中的一员，最初在大鼠的肝脏组织中被发现。Radixin 蛋白主要由三个结构域构成：FERM 结构域、C 末端结构域（C-terminal domain，CTD）以及连接以上两个结构域的中间α结构域。FERM 结构域和CTD 可以分别与膜蛋白和肌动蛋白作用，从而将蛋白固定在肌动蛋白细胞骨架上发挥锚靠作用［25］。2006 年，LOEBRICH 团队通过酵母双杂交筛选的方式首次在大鼠大脑中发现radixin蛋白与α5-GABAA受体存在相互作用，并证实radixin可将α5-GABAA受体锚定在突触外位点［26］。在特异干扰radixin 的表达后，突触外的α5-GABAA受体簇数量明显减少，而稳定radixin 与α5-GABAA受体结合后，可以阻止α5-GABAA受体再分布于抑制性突触内则进一步证明了radixin 在突触外对α5-GABAA受体的锚靠作用［14，23］。

但是radixin 的锚靠作用是磷酸化依赖性的，必须要经过磷酸化修饰发生构象变化被激活后，radixin 才能实现对α5-GABAA受体的锚靠。静息状态下，radixin 处于磷酸化状态，α5-GABAA受体可与radixin 蛋白结合并因此锚靠在细胞骨架，当有兴奋信号传递时，radixin 的磷酸化水平下降，α5-GABAA受体结合不稳定，从而使更多受体进入突触内实现再分布过程［14，23］。然而目前对于磷酸化radixin 的信号通路存在一定争议，认为可能与蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和RhoA/Rock 信号通路有关［27-28］。

PKC 是一种Ca2+依赖的蛋白激酶，最初在非神经元细胞中发现可以参与ERM 蛋白家族的磷酸化过程。α5-GABAA受体再分布过程具有活动依赖性，当兴奋性突触活动时可以增加细胞内的Ca2+浓度并促使radixin 蛋白发生去磷酸化，从而介导α5-GABAA受体的再分布［14］。因此，与Ca2+相关的可调控radixin 磷酸化过程的PKC 进入人们的视野。当使用抑制剂Go 6976 阻断PKC 的活性后，ERM 蛋白的磷酸化水平增加［27］更加可以证明，Ca2+依赖性的PKC可以影响radixin 的磷酸化过程。Rho 具有调节如Rho激酶/ROKα等丝/苏氨酸激酶活性的作用，通过对radixin 蛋白C 末端T564 位点进行磷酸化修饰，Rho 激酶可以改变radixin 蛋白的头尾相连的构象从而使radixin 蛋白被激活［29］。但是当神经元活性发生变化时，RhoA/ROCK 信号通路可以使radixin 发生去磷酸化，而丧失对α5-GABAA受体的锚靠作用，从细胞骨架释放的α5-GABAA受体横向扩散速度增加，进而实现突触和突触外α5-GABAA受体的再分布过程［23］。

3.2 锚靠蛋白gephyrin 在突触内对α5-GABAA受体的锚靠作用及其调控机制 Radixin 发生去磷酸化使α5-GABAA受体从突触外位点被释放，释放后的受体流动性增加并扩散至突触而被位于突触内的gephyrin 蛋白捕获，实现受体从突触外向突触内的再分布［23］。研究［30］显示，与正常对照组相比，降低gephyrin 的表达可以显著增加GABAA受体的流动性，缩短受体在突触部位的停留时间，这足以说明gephyrin 蛋白对受体的捕获在GABAA受体再分布过程中的重要意义。Gephyrin 最初在与甘氨酸受体（glycine receptor，GlyR）共纯化时被发现，随着研究的深入，人们发现gephyrin 与GABA 能抑制性突触存在共定位现象，而通过与肌动蛋白细胞骨架相互作用，gephyrin 可以将膜蛋白与细胞骨架连接发挥其锚靠作用。Gephyrin 主要由G-结构域、E-结构域和C-结构域三个结构域构成，各单体之间可以互相作用形成多聚体，并经PTM 而发挥其锚靠功能［31］。但是与radixin 不同，gephyrin 的PTM 不仅形式多样，而且调节相同PTM 方式的作用位点也并不单一，因此目前对于gephyrin 如何发挥其对α5-GABAA受体的锚靠作用尚不明确。

Gephyrin 的C-结构域可以发生磷酸化修饰，在全身各系统发现的gephyrin 蛋白中，其C-结构域大约存在40个可磷酸化的位点，但在中枢神经系统中，这一数目减少至个位数，其中与gephyrin 的成簇聚集现象密切相关的磷酸化位点之一即Ser270 氨基酸残基。Ser270 位点的磷酸化可以受GAK3β 的调节。在GSK3β 的作用下，该位点发生磷酸化修饰而减少gephyrin-GABAA受体簇的形成，当使用抑制剂将GSK3β 活性抑制后，Ser270 残基发生了去磷酸化，同时gephyrin-GABAA受体簇的密度相应增加。与GSK3β 的作用相同，CDK5 也可以调节Ser270 位点发生磷酸化修饰［32-33］，但令人不解的是，在CDK5的作用下发生磷酸化修饰后对gephyrin-GABAA受体簇造成的影响与GSK3β 完全相反［32］，在这两条信号通路中虽然蛋白发生相同的磷酸化，但最终产生不同结局的原因仍值得进一步探究。除Ser270 位点外，gephyrin 的Ser303和Ser305残基在PKA 和CaMKⅡ的作用下也可以发生磷酸化。同前所述，α5-GABAA受体再分布的发生需要兴奋活动的刺激，同时radixin 构象的改变也与兴奋信号密切相关。与此相一致的是，PKA 和CaMKⅡ作为Ca2+依赖的蛋白激酶，在调节Ser303 和Ser305 位点的磷酸化修饰时也需要兴奋信号的刺激［34］，因此，Ca2+依赖的PKA和CaMKⅡ在调节gephyrin 发挥对GABAA受体的锚靠作用中可能扮演了非常关键的角色。

与上述通路介导的磷酸化修饰不同，DHHC-3可以介导gephyrin 的棕榈酰化修饰。棕榈酰化是将长链脂肪酸通过共价键连接至半胱氨酸残基而对蛋白质进行修饰的一种作用机制，通过棕榈酰化修饰，蛋白与细胞膜的结合程度可以发生改变。目前对抑制性突触中可进行棕榈酰化修饰的蛋白研究较少，其中gephyrin 蛋白就是可以发生棕榈酰化的蛋白之一［35］。在DHHC-3酶的作用下，gephyrin的C-结构域中的Cys212和Cys284两个位点可以被棕榈酰化，使得gephyrin 蛋白与突触后膜的连接更加紧密，进而对质膜表面流动的GABAA受体进行捕获而改变突触的可塑性［36］。随着研究的深入，更多调节gephyrin 修饰的信号通路进入人们的探讨范围，比如对gephyrin 聚集有负性调控作用的S-亚硝基化，对赖氨酸残基Lys148 和Lys724 进行小泛素样修饰物（Small Ubiquitin-like Modifier，SUMO）添加的SUMO化以及乙酰化等，都被发现可以改变突触后膜上gephyrin蛋白簇的表达量［37-38］。更为复杂的是，在多条信号通路中，不同的修饰方式可能会相互作用、互为补充，这种复杂性使得人们对gephyrin 蛋白的研究变得愈发困难。

综上所述，在双锚靠机制的作用下，α5-GABAA受体可以完成在突触内外的再分布进而影响学习和记忆等认知功能，这可能是探究POCD 发生机制的重要靶点。但是在双锚靠机制发挥作用的过程中，radixin 和gephyrin 似乎存在完全独立的调节机制，对于是否存在一些共同的作用机制影响两者的活性以及两者在α5-GABAA受体的再分布中如何协调配合发挥作用等问题目前均无研究。因此，研究radixin 和gephyrin 在α5-GABAA受体再分布过程中的双锚靠机制在相关疾病发生发展过程中的作用将会是接下来研究的重点，可能为治疗相关疾病提供新的思路和方法。