抗菌肽抗菌活性评价及应用研究进展

李洪宇，刘扬科，何 涛，郭柑彤，吴玉臣，陈华丽

（1.中农颖泰林州生物科园有限公司，河南 林州 456550；2.农业农村部饲用抗生素替代技术重点实验室，河南 林州 456550；3.河南牧业经济学院，郑州 450046；4.西南科技大学，四川 绵阳 621000）

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一种具有抗菌活性的小分子多肽，是维护宿主细胞防御外来病原菌感染的第一防御屏障。抗菌肽一般由10～50 个氨基酸组成，存在于各种动物、植物、细菌、病毒和人体当中，来源非常广泛，是机体防御系统的重要组成部分。目前在APD 数据库（http://aps.unmc.edu/AP/main.php）中共收录3 250 种抗菌肽[1]，按照来源不同，可分为动物源抗菌肽（如天蚕素和蛙皮素）、植物源抗菌肽（如硫堇和植物防御素）、微生物源抗菌肽（如肠杆菌肽和枯草菌肽）及人工抗菌肽等。

抗菌肽最广泛和重要的应用是作为抗菌物质使用，但不同于抗生素，抗菌肽具有广泛的抗菌活性，其抗菌机制主要为：带正电荷的抗菌肽通过静电作用直接与带负电荷的细菌细胞膜结合，通过膜穿孔作用造成细菌死亡。另外，部分抗菌肽还具有抑制细胞壁、DNA、RNA 和蛋白质合成的胞内损伤作用机制。总之，多作用机制和多作用靶点的抗菌特性使抗菌肽在应用过程中产生耐药性的概率较低。所以，在抗生素耐药和食品安全的背景下，抗菌肽抗菌效果受到了从业人员的热切关注。另外，由于抗菌肽存在一些特殊的二、三级结构，使部分抗菌肽对高温、酸、碱及胃蛋白酶和胰蛋白酶具有良好的抵抗力[2]，因此在饲料加工过程和动物应用中几乎不受影响。随着对抗菌肽的深入探索与开发，人们对抗菌肽分子结构及功能机理的认知也越来越丰富。作为新型的抗生素替代品，抗菌肽结构明确，机理清晰，作用确实[3-5]，本文重点概述了抗菌肽的抗菌活性的评价及其在养殖业中的应用，以期为抗菌肽在替代抗生素推广应用方面提供参考依据。

1 抗菌肽抗菌活性评价

作为抗菌能力最接近抗生素的小分子活性多肽，抗菌肽抗菌谱广，可高效防控临床中常见致病菌如金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌引起的细菌性疾病[6]，且由于其独特的物理性抗菌机制降低了细菌耐药性的产生概率，在替代传统抗生素方面具有较大优势。

在评价抗菌肽抗菌活性时，通过观察计算抑菌圈、抑菌率和最小抑菌浓度（MIC）能够客观地反映抗菌肽的体外抗菌效果，从而为进一步的体内试验提供理论依据。汪以真等[7]采用微量肉汤稀释法研究发现，天蚕素对大肠杆菌K88 和ATCC25922 的MIC 分别为0.25 mg·L-1和0.5 mg·L-1，较盐酸金霉素（MIC分别为8 mg·L-1和4 mg·L-1）、土霉素（MIC同为2 mg·L-1）、林可霉素（MIC 分别为1 mg·L-1和2 mg·L-1）等常用抗生素低，并且对猪源、禽源沙门氏菌也具有更好的抗菌效果，说明总体上天蚕素的抗菌活性高于抗生素。周芳等[8]采用牛津杯法测定天蚕素对金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌等4种水产动物病原菌的MIC分别为0.8、0.8、1.6、3.2 mg·L-1，其抗菌效果优于大黄、黄连、艾叶、乌梅、石榴皮等中草药提取液，并且随着天蚕素质量浓度的增加，抑菌圈直径在增加，说明其抗菌作用在不断增强。卜艳玲[9]试验表明，针对大肠杆菌野毒株Z1，在相同浓度下，硫酸黏杆菌素、天蚕素、肠杆菌肽的MIC分别为256 mg·L-1、128 mg·L-1和小于64 mg·L-1，肠杆菌肽抑菌圈直径最大，说明肠杆菌肽抗菌效果优于硫酸黏杆菌素，而且肠杆菌肽在高温（85～110 ℃下作用5 min）、酸（pH值=2时作用15～60 min）及胆盐（0.3%胆盐下作用15～60 min）条件下，其抑菌圈直径保持21 mm，表明肠杆菌肽抗逆性强，在胃肠道中稳定性高。于海涛[10]采用微量肉汤稀释法和打孔法研究发现，肠杆菌肽MccJ25 对标准和临床来源大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌及临床分离的耐药性大肠杆菌和沙门氏菌（耐林可霉素和替米考星）的 MIC 值为 0.03 μg·mL-1；用不同梯度温度（37～121 ℃）、pH 值2～9 的胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶处理肠杆菌肽MccJ25 不同时间后，其对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径分别大于22 mm和19 mm，仍保持有强抗菌活性。王庆伟[11]发现枯草菌肽Sublancin 对金黄色葡萄球菌呈现良好的抗菌效果，采用微量肉汤稀释法测定Sublancin 对金黄色葡萄球菌甲氧西林敏感菌株CVCC1882和耐甲氧西林菌株ATCC43300 的MIC 分别为3.75 mg·L-1和60 mg·L-1。王帅[12]采用抑菌圈法发现枯草菌肽Sublancin对产气荚膜梭菌CVCC2027具有较好的体外抑菌活性，但MIC 远高于林可霉素。而在体内试验中，枯草菌肽Sublancin 显著降低了爱拔益加肉鸡盲肠中产气荚膜梭菌的数量，且其治疗剂量远低于林可霉素（5.76 mg·L-1对比 75 mg·L-1），与Wang Q. W. 等[13]对枯草菌肽Sublancin 的研究结果类似。

2 抗菌肽在养殖业中的应用

目前，饲料端已全面禁止添加抗生素类添加剂，因抗菌肽抗菌谱广，抗菌作用机理独特，主要作用于肠道，特别是能到达后肠，杀菌彻底，无残留，不易产生耐药性等诸多优点，作为绿色安全的饲料替抗物质，可高效防控养殖当中的细菌性疾病，调节动物的肠道菌群平衡，提高饲料转化效率和动物生长性能。

2.1 抗菌肽在猪养殖中的应用

抗菌肽对临床中引起仔猪腹泻的大肠杆菌、沙门氏菌等常见致病菌有较好的抗菌效果[14]，可促进有益菌增殖，抑制有害菌生长，降低粪便中大肠杆菌等病原菌数量，增强仔猪抗病能力[15-16]。宦海琳等[17]试验发现，饲粮中添加300 mg·kg-1的天蚕素，仔猪腹泻率由9.09%降低至6.16%，平均日增重提高4%。卜艳玲等[18]试验表明，日粮中添加300 g·t-1天蚕素、500 g·t-1肠杆菌肽，断奶仔猪腹泻率分别降低78.3%和100%，仔猪平均日增重分别提高4.7%和10.5%，两种抗菌肽效果都优于30 g·t-1的硫酸黏杆菌素。熊海涛等[19]研究发现，无抗日粮中添加300 mg·kg-1肠杆菌肽可有效抑制仔猪肠道中致病性大肠杆菌和沙门氏菌数量，使哺乳阶段和保育阶段仔猪腹泻率显著降低。

2.2 抗菌肽在禽养殖中的应用

大量研究证实饲料中添加抗菌肽可以提高家禽抵抗病原菌感染的能力[20-21]。张琳等[22]研究表明，天蚕素在预防肉鸡坏死性肠炎方面效果良好，与恩拉霉素相比，肉鸡粪便中产气荚膜梭菌数量下降比例提升7.5%。丁修良等[23]对感染大肠杆菌的爱拔益加肉鸡进行试验，发现在饲粮中添加300 mg·kg-1枯草菌肽Sublancin 显著降低了肉鸡盲肠中的大肠杆菌数量，治疗效果与金霉素相当。王帅[12]验证了枯草菌肽Sublancin对引起肉鸡坏死性肠炎的产气荚膜梭菌具有良好抑制效果，保护肠道免受有害菌的破坏，维持肠道微生态平衡，综合改善了肠道健康。田丽娜等[24]试验表明，饲粮中添加适量的枯草菌肽Sublancin 可提高蛋鸡脾脏指数及胸腺指数，对蛋鸡的免疫功能和抗病力具有促进作用。

2.3 抗菌肽在反刍动物养殖中的应用

宋丽华[25]试验表明，在治疗奶牛乳房炎时，抗菌肽组治愈率为57.9%～58.8%，有效率为31.6%～35.3%，疗效等同或略优于恩诺沙星（治愈率为60%，有效率为20%）。王庆伟等[26]报道，与青霉素相比，相同浓度的枯草菌肽Sublancin 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300 具有更好的抗菌活性。单玉雪等[27]研究发现，与万古霉素相比，抗菌肽对导致奶牛乳房炎的无乳链球菌和乳房炎临床分离株的抗菌活性分别提高2.91倍和6.09倍。王静[28]试验证明重组牛LAP-CATHL2 抗菌肽对致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 为31.25 μg·mL-1，对致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎治疗效果明显。

2.4 抗菌肽在水产养殖中的应用

M.G.Kwon 等[29]报道，在饲料中添加抗菌肽显著提高了迟缓爱德华氏菌和伊氏链球菌攻毒后的牙鲆和黑石鱼的存活率。闫春梅等[30]发现使用抗菌肽浸泡可显著抑制虹鳟体表细菌滋生，苗种成活率由30%提高到95%。林鑫等[31]发现饲粮中添加天蚕素可显著提高锦鲤的总抗氧化能力和抗病性能。王自蕊等[32]选取初均重为（46.14±0.13）g 的湘云鲫1 242 尾，分成6 组，分别在基础饲料中添加4 mg·kg-1金霉素及0、100、150、200、250 mg·kg-1天蚕素抗菌肽，结果表明在饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫有促生长效果，且150、200 mg·kg-1添加组效果较佳，同时提高了鱼体的非特异性免疫功能和抗病力，并具有促生长效果。董晓庆[33]发现通过促进促炎和抗炎因子的调整，天蚕素可提高建鲤抗氧化能力和免疫功能。

3 小结与展望

基于抗生素耐药性的共识，国内外对抗菌肽的生物活性、作用机制和改造表达等方面进行了大量研究，但受限于种种因素，能够应用于饲料中的替抗抗菌肽产品却少之又少。主要影响因素包括：（1）天然抗菌肽表达量低，重组抗菌肽分离纯化困难，因此需要选择合适的宿主菌，提高抗菌肽的表达量，提高产业化水平，降低生产和使用成本；（2）抗菌肽分子量小，存在部分结构不稳定问题，而且一级结构中含有的一些碱性氨基酸在动物体内易被胰蛋白酶消化水解，导致在应用时抗菌作用减弱或消失；（3）与抗生素相比，大部分抗菌肽抗菌活性还不够理想，需要复配其他替抗产品，且关于药效学及药代动力学方面的研究较少，一定程度上限制了其应用。当然，随着进一步探索研究，相信抗菌肽的功能优化与市场产业化一定能够完成，从而真正实现完全取代抗生素，做到无抗养殖。