外泌体复合支架用于口腔组织工程的研究进展

蔡超莹 陈学鹏 胡济安

1.浙江大学医学院附属口腔医院正畸科，浙江大学口腔医学院，浙江省口腔生物医学研究重点实验室 杭州 310006；2.浙江大学医学院附属口腔医院病理科，浙江大学口腔医学院，浙江省口腔生物医学研究重点实验室 杭州 310006

临床常见的颌面部组织缺损包括骨缺损、关节损伤、牙体及牙周组织破坏等，这会严重影响患者的美观与功能，甚至威胁机体健康。口腔组织工程的发展为颌面部软硬组织修复提供了可能。组织工程的三大要素为支架、生长因子和干细胞[1]，其中干细胞复合支架被广泛应用于组织再生。但大量研究表明，干细胞存在提取、储存、运输困难等问题[2]，同时细胞突变[3]、伦理问题[4]也限制了其临床应用。对此，有学者[5]提出将外泌体等细胞旁分泌产物与支架复合，提高组织再生的效率。

口腔内不同组织再生机制存在差异，本文就外泌体复合支架在口腔颌面部组织再生中的研究作一综述。

1 外泌体与支架

1.1 外泌体的获取与生物学特性

外泌体是细胞分泌的包含mRNA、蛋白质等生物活性分子的细胞外囊泡结构[6]，其体积小（直径为30～150 nm）、可用率高，产量及功能受细胞种类、培养、分离及储存条件的影响。外泌体可由免疫细胞、干细胞、内皮细胞、肿瘤细胞等分泌得到，并广泛分布于血清、唾液、尿液等体液中[7]。干细胞是外泌体的主要来源，其中脐带间充质干细胞培养得到的外泌体产量最高[8]；免疫细胞、肿瘤细胞来源的外泌体分别在炎症调节、肿瘤监控上具备优势。细胞培养过程中，双室生物反应器、3D培养基、适宜的细胞接种密度（60%～90%）、缺氧预处理、高或低含量葡萄糖均有利于外泌体的产生；热应激、氧化应激以及西他沙星等药物处理也能提高产量；表皮生长因子则会降低产量[9-10]。可用于外泌体分离的方法包括超速离心、超滤、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀、微流体分离和免疫捕获等[11]。超速离心是使用最广泛的分离方法[12]，但存在杂质共分离、重现性低等问题；切向流技术可提高超滤过程中膜的使用率及外泌体产量[13]；微滤离心结合了超滤及超速离心技术，可获得高纯度、高产量的外泌体[14]。分离外泌体后，需对其进行有效的体外储存，温度和时间均会影响外泌体的稳定[15]，4℃适用于1周内的短期储存，-80℃则利于长期保存[16]。获取外泌体的各个环节都需要严格把控，但建立标准化细胞培养条件是获得充足且稳定的外泌体的重要前提[9]。

体内研究[17]表明外泌体易通过毛细血管循环，将携带的生物信息准确递送至靶组织；同时，外泌体免疫原性低，不易引起人体的排斥反应[18]。此外，已有大量的研究报道了外泌体在血管生成[19-20]、免疫调节[21]、成骨[22-23]、成牙[24]、神经保护及再生[25]等方面的效能及特性。但外泌体在体内移植时存在缺陷，巨噬细胞会清除经静脉注射进入体液循环的外泌体，使到达靶组织的外泌体浓度低于有效治疗浓度[26]，导致治疗效果不佳；而在肝脏、肺等其他组织中的无效积累有可能造成机体负担[27]，这些问题均限制了外泌体的临床应用。

1.2 支架的材料与结构

支架作为组织工程学的另一重要元素，通过模拟细胞外基质的结构和功能特性来实现受损组织的修复或再生。理想的支架需要具备几大特性：良好的生物相容性、足够的机械强度、适宜的表面活性以及合适的孔隙率[28]。

目前，可用于口腔组织工程的支架材料包括合成聚合物、天然聚合物和生物陶瓷等。最常用的合成聚合物包括聚己内酯、聚丙交酯、聚乙醇酸等[28-29]。它们的优势在于物理化学性能可控[30]，调整分子量、结晶度或共混比例可改变其降解速率，多用于骨、软骨、牙体和牙周组织再生。天然聚合物如蛋白多肽、多糖等因其结构与天然的糖胺聚糖相似[31]，具有良好的生物相容性及潜在的生物活性，被广泛用于关节软骨的再生。磷酸钙类的生物陶瓷材料与骨骼中的无机成分相似，机械性能良好，多用于骨和软骨再生[32]。水凝胶代表一类具有亲水性三维聚合物网络的材料[33]，可由多糖等天然材料或聚乙二醇等合成聚合物通过化学交联、光聚合、热塑或冷冻等方法制得，具备良好的弹性、生物相容性、可调的降解性和机械性能，多用于模拟细胞外基质或生物递送[34]。非共价交联形成的水凝胶具有应力松弛、剪切稀化等特性，便于注射，可用于软骨、牙体和牙周再生[35]。将羟磷灰石或纳米黏土加入水凝胶可增强其机械强度及抗降解性，适用于骨和软骨再生[36-37]。

支架应起到介导细胞和组织浸润、支持血管和神经生长的作用，因此需具备合适的孔径、孔隙率等。有研究[38-39]表明：孔径300～500 μm的多孔支架有利于成骨，40%～90%的孔隙率可促进骨整合，孔隙互连能促进细胞向内均匀生长及分布[40]。此外，组织缺损通常累及多层解剖结构，为了实现复杂的组织再生，支架已从最初的单相支架衍生出双相、三相支架，近年来多相梯度及连续梯度支架已成为支架设计的热点[31]。单相支架由单一材料或一种复合材料组成，孔径、孔隙率等特性较为单一[29]。双相、三相支架结合了2～3种不同的材料、复合材料或架构形成多层结构，各层之间的孔径、孔隙率及互连性不同[41]，已用于仿生分层组织如关节软骨及牙周缺损。多相离散梯度和连续梯度表现为化学及结构组成在整个构架区域内的广泛梯度分布，包括排列、分散、尺寸、方向等[31]，更利于支架与宿主的整合。

1.3 外泌体与支架的复合

外泌体对组织工程的发展具有重要价值，但体内环境的干扰限制了其临床应用。而针对不同材料和结构的支架的特性研究已较为深入，可为外泌体的体内递送提供安全、稳定的载体。因此，研究者将外泌体与支架复合，以实现外泌体的装载、递送及缓释。目前已有文献报道了多种复合技术，包括物理吸附[42-43]、化学交联[44-45]、特异性结合[46-47]、冻干[48-49]、3D打印[50]等。直接吸附通常难以控制外泌体的突释[42]，利用聚乙烯亚胺、聚多巴胺（poly dopamine，PDA）等对支架表面进行化学改性可有效改善这一点[43,51]。化学交联包括离子交联、光交联等方法，强化学键可实现外泌体与支架的长期稳定结合，但易破坏外泌体膜及支架结构[44]。利用锚定肽、生物特异性肽等介导外泌体与支架复合的方法不仅能保持外泌体的完整性，还实现了稳定装载[47]。冻干法能将外泌体固定在多孔支架中且不影响其形态和生物活性[48]，3D打印则使外泌体均匀分布于多孔支架内。

缓释能力是衡量复合技术可行性的重要指标。有研究[43,51]发现：经皮下注射的外泌体在1 d内即被清除殆尽，直接吸附于支架的外泌体可在4 d内释放完全，而与表面改性的支架复合的外泌体在体内释放1周后仍可保留30%～50%。经离子交联装载外泌体的藻酸盐水凝胶在3 d内释放外泌体超过50%，之后缓慢释放至完全[44]。生物特异性肽介导的外泌体复合支架在12 h内快速释放外泌体达30%，1周总释放量为70%[47]。装载外泌体的冻干支架在第1周表现出快速释放，14和28 d的释放量分别为71.4%和75.4%[48]。3D打印径向支架在体外14 d时仍保留了超过56%的外泌体，体内缓释总时长超过1周[50]。以上研究表明：与支架复合的外泌体的释放曲线呈初期快速大量释放、后趋于平缓稳定，体内缓释时长普遍超过1周，与直接注射的外泌体保留时长存在显著差异。基于多样化的复合技术及其良好的缓释性能，外泌体复合支架具有可行性及临床意义，有望提高组织再生效率。

2 外泌体复合支架与组织再生

2.1 外泌体复合支架用于颌骨再生

颌面部骨缺损的传统修复方法包括自体或异体骨移植、牵张成骨等，在临床中能达到一定的修复效果，但存在免疫排斥、美观不足等缺陷。骨组织工程的发展有望解决以上问题，实现骨的“重生”。血管生成和成骨是骨再生的关键[52]。在骨缺损区，骨组织呈现高度血管化，大量血管分布在成骨细胞周围，促进骨基质的合成与矿化，因此骨的重塑侧重于诱导血管形成。

多项体外研究[42-43,53]结果表明：生物陶瓷、聚合物等材料与外泌体的复合可以促进干细胞的增殖迁移、成骨分化，诱导骨的矿化及血管形成。当前外泌体用于颅颌面骨再生的体内研究模型主要为颅骨、牙槽骨缺损模型等[54]。一些学者[42,55]分别在颅骨缺损及牙槽骨缺损大鼠模型中研究了外泌体/β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）复合支架的骨再生效能，结果显示复合支架增强了成骨及血管形成。Chen等[56]将外泌体与水凝胶置入颅骨缺损区原位交联，其新骨形成范围显著大于纯水凝胶组。PDA涂层可有效改善聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]的缓释性能[57]，Li等[43]将外泌体吸附于PLGA/PDA支架并植入小鼠颅骨缺损区，PLGA/PDA-外泌体组较对照组形成了更多新骨。Swanson等[58]设计了聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-聚乳酸羟基乙酸共聚物包裹外泌体形成微球，将聚合物微球吸附于3D聚L-乳酸多孔纳米支架并植入颅骨缺损模型，观察到缺损区生成了含骨髓的骨组织并在8周时与宿主整合，实验中未表现出任何炎症反应，提示支架及其降解产物的生物相容性良好。Liu等[48]开发了分层介孔生物活性玻璃支架对外泌体进行冻干递送，体内实验表明骨形成显著增加，成骨相关标志物表达增强。

在多种复合技术的依托下，多相支架能以微球或微孔的形式有效保留和缓释外泌体，但材料间相互作用可能衍生的新特性仍需进一步探索。此外，当前用于外泌体复合支架骨再生研究的体内模型大多为小型哺乳动物的颅骨缺损模型，有必要建立兔、犬等大型动物颌骨缺损模型进行临床前研究。

2.2 外泌体复合支架用于颞下颌关节软骨再生

颌面部的主要软骨组织位于颞下颌关节区，当颞下颌关节病变持续进展，关节软骨及其下方骨质会发生不同程度的破坏。针对骨关节炎造成的软骨破坏，临床早期主要通过物理、药物或稳定咬合板等方式进行保守治疗，严重者酌情介入治疗，包括关节腔封闭、灌洗、微断裂手术等[59]。软骨再生是骨关节病治疗的终极目标，不同于骨组织再生，软骨组织中无血管分布、自我修复能力弱，因此软骨细胞与基质是其再生的基础。

目前，外泌体用于关节软骨再生的方式包括静脉或关节腔直接注射、结合支架注射等[60]，在支架材料中，水凝胶以其独特的物理化学性能得到了研究者的高度关注。外泌体复合支架用于颞下颌关节软骨再生的体内研究尚少，而膝关节与颞下颌关节的解剖结构及神经分布高度相似[61]，因此基于膝关节的研究具有重要的参考价值。Liu等[45]通过光诱导亚胺交联将外泌体与水凝胶结合形成脱细胞组织补片用以修复膝关节软骨缺损，体内外实验显示：脱细胞组织补片可诱导并促进软骨再生，且与天然软骨无缝整合。目前，临床上的软骨修复技术以诱导纤维软骨生成为主，存在杨氏模量低、耐久性差等缺点[62]。Jiang等[37]利用脱细胞软骨基质吸附外泌体，得到了杨氏模量更高、胶原更丰富的再生软骨。Chen等[50]应用光固化成形（stereo lithography apparatus，SLA）技术制造了具有径向通道的脱细胞软骨外基质/甲基丙烯酸化水凝胶/外泌体3D复合支架，显著促进了软骨细胞的迁移并修复了软骨线粒体的功能障碍，增强了软骨再生。

关节结构由表及里依次为关节软骨、钙化软骨和软骨下骨，已有大量研究利用干细胞与多相支架复合实现骨软骨区的分层再生，未来有望通过外泌体复合多相梯度支架实现关节仿生。此外，当前有关外泌体复合支架用于软骨再生的体内研究多集中于膝关节炎[63]。颞下颌关节结构较为复杂，有必要进行基于该区域缺损模型的体内研究，以探索颞下颌关节区软骨再生的理想条件。

2.3 外泌体复合支架用于牙髓再生

牙体组织再生的关键是牙髓样组织的再生，包括细胞的增殖迁移、细胞分化、血管形成及神经再生[64]。临床处理牙髓坏死的方法是将坏死的牙髓摘除后，利用生物材料进行严密的根管充填，但存在根管消毒不彻底、牙体组织破坏性大等风险[65]，且去除牙髓会使患者无法感知龋的进展。因此，保留牙髓对患者感知创伤及牙本质的修复具有重要价值。目前，临床已通过血运重建来实现牙髓“再生”，但这仅适用于根尖发育不全的年轻恒牙发生牙髓坏死的情况，其根本在于诱导形成骨样、牙骨质样及牙周膜样组织，无法实现功能性的牙髓再生[66]。

有效的再生依赖于彻底的根管消毒及细胞归巢等内源因素，临床效果难以预测，但组织工程的发展为牙髓再生提供了新思路。研究者[67]针对外泌体复合纤维蛋白凝胶对牙髓干细胞的募集及增殖能力进行体外研究，结果显示：外泌体和纤维蛋白均增强了干细胞的募集，且具有累加效果[68]；外泌体显著增强细胞增殖。Huang等[69]利用精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸类多肽介导外泌体与Ⅰ型胶原膜复合填充于根管切片并植入大鼠体内，观察到牙髓样组织特别是血管的形成。Zhang等[70]的研究表明：外泌体与纤维蛋白凝胶共注射交联可促进血管化，包括加速胶原蛋白基质沉积、细胞凋亡和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）释 放。两 亲 性 三 嵌 段PLGA-PEG-PLGA共聚物作为一种三相支架用于装载外泌体，体内研究证实缓释的外泌体可在病损区域持续促进修复性牙本质的形成[71]。

复杂与封闭的牙髓环境导致再生牙髓存在很大挑战，利用支架精准递送外泌体进入髓腔并控制缓释是治疗的关键[72]，可注射支架材料及多相结构有望实现这一点。

2.4 外泌体复合支架用于牙周再生

对于牙周病、根尖周炎或囊肿造成的牙周组织缺损，临床常通过引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）、自体骨移植和异体骨充填进行修复[73]。研究[74]表明：牙釉质基质衍生物诱导和促进垂直型骨吸收患牙牙周再生的效果良好；自体或异体骨移植可为大范围的骨吸收患牙提供空间支撑，实现血凝块的稳定[75]。这些方法丰富了传统的牙周治疗手段，但仍存在适用范围窄、技术敏感性高[76]、组织继发缺损[77]及免疫排斥等问题，治疗效果不明确。

随着外泌体的优势被逐步发掘，研究者[78]利用胶原蛋白海绵吸附外泌体植入牙周缺损区，促进了牙槽骨及牙周膜的再生，但表现为上皮沿根面向下生长。Liu等[79]将5%明胶和10%合成锂皂石共混得到适合牙周临床应用的水凝胶，实验表明：经改建的水凝胶与外泌体交联，在牙周炎大鼠模型中抑制了炎症的进展、牙槽骨的吸收及胶原纤维的破坏，上皮沿根面生长情况有所改善。Shen等[80]将壳聚糖水凝胶与外泌体共注射入牙周炎小鼠实现原位交联，减轻了小鼠因牙周炎诱发的上皮病变及牙槽骨丧失，并揭示了其抑制炎症的机制，促进巨噬细胞由促炎表型转化为抗炎表型。

牙周组织再生对牙周、正畸、种植等临床工作的意义重大，但目前利用外泌体复合支架进行牙周再生的体内外研究尚少。长上皮结合是目前临床牙周愈合的主要形式，随着牙周组织工程理念的不断更新，现已研发出与牙周复合体包括牙槽骨、牙周膜、牙骨质相对应的三相支架，用以精准恢复缺损的分层组织，但仍需要大量研究证实其临床可行性。

3 小结

自口腔组织工程引入无细胞疗法后，外泌体的高效利用一直是临床应用的难点，利用支架进行装载、递送及缓释具有可行性。外泌体与支架在口腔组织再生中协同作用，展现出优异的生物及物理化学性能。在骨、软骨再生方面，外泌体复合支架有效提高了再生效能并提供结构支撑，多相支架及3D打印技术推动组织工程实现了高度仿生。牙体、牙周组织因其环境的复杂性，相关研究较少，安全的支架材料及高效的复合技术将是未来研究的重要方向。此外，各材料与外泌体间的相互作用可能获得的新特性仍需进一步探索。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。