程序升温-气相色谱-同位素比值质谱法分析多环芳烃单体碳同位素组成

谢曼曼，刘美美，凌媛，孙青*

(1.国家地质实验测试中心，北京 100037；2.中国地质科学院地质研究所，北京 100037)

多环芳烃(PAHs)的分子组成特征(如环数分布、同分异构体比值)与其来源相关[1-6]，但PAHs多数为半挥发性有机物，受环境介质、光氧化、生物降解及迁移过程的影响，其分布模式或相对浓度会发生改变。PAHs的单体碳同位素比值在迁移转化过程中基本保持稳定，可作为溯源指标[7]。

单体碳同位素比值分析技术已经逐渐被应用于大气颗粒物[8-11]、表土[12-14]、沉积物[14-19]等不同环境样品中的PAHs溯源。同位素比值质谱(IRMS)单体碳同位素分析结果受绝对进样量影响[20-22]，实现精确分析则需要石英毛细色谱柱内的每个化合物至少含有1nmol的碳[23]，谱峰强度达到200mV以上[24]。因此，PAHs单体碳同位素分析各单体的绝对进样量需要达到10ng以上，比气相色谱分析所需进样量至少要高一个数量级。IRMS分析灵敏度相对较低，有必要优化进样口模式及参数，提高目标物谱峰强度，以实现低PAHs含量的环境样品的高精度、准确分析。随着气相色谱-同位素比值质谱(GC-IRMS)在环境监测和溯源等方面应用需求的增加，多种进样口系统被开发，其中分流/不分流和冷柱头进样口的样品容量低，一般进样量不超过2μL[25-28]。程序升温汽化(PTV)可以增加进样量，提高目标物谱峰强度，还有助于消除分流/不分流热进样模式中会出现的进样针内高沸点目标物歧视、衬管内大体积蒸汽云等。PTV技术结合气相色谱-质谱或液相色谱-质谱已成功应用于PAHs[25,29-34]、农药残留[35-41]及其他空气中的有机污染物[42-43]的定量半定量分析。PAHs单体碳同位素分析中应用PTV进样技术的报道则比较少，且多结合大体积进样装置，如Mikolajczuk等[24]利用大体积(进样量为100μL)PTV进样技术将6种PAHs包括蒽、荧蒽、芘、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘的单体碳同位素分析检出限降至0.07～0.3μg/mL；Blessing等[23]利用液氮冷却装置进一步降低了PTV的初始温度，进样量在150μL时2～5环的PAHs(包括挥发性较强的萘或苊)的单体碳同位素检出限低至0.04～0.1μg/mL。大体积进样装置价格相对昂贵，因此针对正常进样量(≤5μL)，优化建立高精度、准确的单体碳同位素分析PTV进样方法很有必要。

与传统分流/不分流进样口相比，PTV进样口的影响参数更多。本文对比了PTV进样口的3种进样模式(恒温不分流进样、PTV不分流进样和PTV溶剂分流)，对进样口多个参数(压力梯度、传输温度和时间、蒸发温度和时间、不分流时间)进行了优化，并对比了增加预柱对目标物峰形的影响。优化后的PTV-GC-IRMS方法的准确度利用较为成熟的EA-IRMS方法进行验证，尝试对GC的系统性同位素分馏进行校正。

1 实验部分

1.1 仪器及工作条件

(1)GC-IRMS分析：PTV进样口-Trace 2000气相色谱仪-GC/C III接口-MAT253质谱仪(ThermoFisher公司)。配备的PTV进样口能够实现PTV分流、PTV不分流(SS)、PTV溶剂分流(SL)、恒温(CT)分流和恒温不分流5种进样模式。

工作条件为：氧化炉温度950℃，还原炉温度640℃；PTV进样口，高纯氦气作为载气，流速2.0mL/min；DB-5MS色谱柱，柱箱程序升温条件为：初始温度60℃，保持5min，以4℃/min升至320℃，保持10min。

(2)EA-IRMS分析

FLASH1112元素分析仪-Conflo Ⅲ接口-MAT 253质谱仪(ThermoFisher公司)。工作条件为：高纯氦气为载气，Conflo-He载气压力100Pa，EA内Carrier-He载气流速90mL/min，氧气流速180mL/min；氧化还原管温度960℃，oven温度50℃，注氧时间3s；氧化还原管填料由下至上分别为：50mm含银氧化钴、100mm铜、50mm氧化铬，各填料之间以10mm石英棉间隔。

1.2 材料、标准溶液和主要试剂

DB-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,J&W公司)；锡杯(4mm×6mm,美国ThermoFisher公司)。

碳同位素工作标准：尿素(δ13C=-49.1‰)；植物表皮(δ13C=-9.0‰)；甘氨酸(δ13C=-33.3‰)。

正己烷(农残级，TEDIA公司)。

氦气、二氧化碳、氧气(纯度≥99.999%,北京市北温气体制造厂)。

1.3 实验样品

样品a：EPA610逐级稀释为6μg/mL。样品a中含有16种PAHs组分，苯环数分布在2～5，沸点分布范围较广，可用于模拟环境样品。

1.4 实验方法

(1)方法优化

利用样品a对GC-IRMS的PTV进样口的多个参数进行优化，包括进样模式(恒温不分流、PTV不分流和溶剂分流)，进样口压力(30、40、60、70psi)，传输温度(280℃、300℃、320℃)，传输时间(0.5、0.8、1.0、1.5min)，蒸发温度(40℃、45℃、50℃、55℃)，蒸发时间(1.5、2.0、2.5、3.0min)，进样口不分流时间(0.8、1.0、1.5min)。每次进样量为5μL，每种参数条件下均连续分析3次。

(2)方法验证

EA-IRMS分析方法有国际标准可以监控、校准。本文以EA-IRMS分析获得的5种PAHs固体单标的碳同位素值作为工作标准(样品b)的标准值，以验证优化后的PTV-GC-IRMS方法的准确性。5种PAHs固体单标各称取5个，单个样品的纯碳量控制在60μg左右，用锡杯包好后利用EA-IRMS分析；样品b利用优化后的PTV-GC-IRMS方法分析，重复进样5次，每次进样量为5μL；对比PTV-GC-IRMS和EA-IRMS碳同位素分析结果。

图2 (a)PTV不分流和(b)PTV溶剂分流模式的温度和时间序列Fig.2 Temperature and time series of (a) PTV splitless and (b) PTV solvent split mode

2 结果与讨论

2.1 进样模式的选择

图1 不分流模式下进样口恒温(CT)与程序升温(PTV)的PAHs峰强度对比Fig.1 Comparison of intensity of PAHs by CT and PTV splitless modes

对于低含量样品分析，进样模式通常选用恒温不分流(CT)、PTV不分流(SL)或PTV溶剂分流(SS)。在相同进样量情况下，对比考察了SL模式(进样口初始温度45℃、蒸发温度45℃、传输温度320℃)和CT模式(进样口温度300℃)的分析结果。如图1所示，SL模式(PTV-1至PTV-3)的样品传输效率明显更高，峰强度提高数倍，且沸点越高的PAHs峰强度增加越明显；CT模式(CT-1至CT-3)基本无法检出沸点高于芘的PAHs。这可能是由于CT模式下样品注入衬管后会迅速汽化形成大体积蒸汽，体积过大时部分蒸汽甚至会通过Purge气路逸出，造成谱峰强度降低。尤其该进样口的专用衬管内径比传统的分流/不分流衬管小，更容易产生大体积蒸汽云。而PTV冷进样模式下进样针头插入进样口时不会被明显加热，可以减少样品在进样针内汽化产生的高沸点目标物歧视，有利于提高高环数PAHs的峰强，同时温度逐步升高不易形成大体积蒸汽。

SL模式在样品注入之初分流阀处于关闭状态，随着温度升高溶剂和目标物组分逐步汽化后分别传输进入色谱柱(图2)。SS模式在样品注入之初分流阀为开启状态；溶剂首先汽化后大部分经过分流气路清除，目标物则在衬管中富集；分流阀关闭后目标物随温度升高逐步汽化并被传输至色谱柱(图2)。

在进样口初始温度45℃、蒸发温度45℃、传输温度320℃条件下，对比SL和SS两种进样模式下16种PAHs的峰强和单体碳同位素分析精密度。SS模式下萘的峰强度大幅度降低，苊烯、苊和芴也有不同程度地降低，但沸点高于芴的PAHs的峰强度相对提高(图3a)，这可能与溶剂和目标物的沸点有关。溶剂的沸点要求低于目标物组分至少150℃，否则目标物会受到溶剂蒸发的影响[43]。正己烷溶剂的沸点约为69℃，萘、苊烯、苊和芴(沸点分别为217.9℃、265℃、279℃、294℃)分别受到不同程度的溶剂蒸发分流的影响，而沸点更高的组分不受溶剂蒸发影响，且在溶剂分流的聚焦作用下峰强提高。SL模式下，萘、苊烯、苊的谱峰相对更宽，其他PAHs组分峰宽则略小或差别不大(图3b)。可能是SL模式受到溶剂效应影响初始谱带展宽，而SS模式下绝大部分溶剂经过分流口消除，溶剂效应影响更小。重复分析三次，SS模式对低沸点PAHs(萘、苊烯、苊、芴、菲)单体碳同位素的分析精度比SL略差(表1)，这可能是由于SS模式下低沸点组分部分随溶剂一起蒸发、分流。

在单体碳同位素分析中，SL模式下样品传输效率明显优于CT模式；当目标物皆为高环数PAHs时，SS模式峰强更高，碳同位素分析精度不受影响(表1)；当样品组分沸程较宽或更关注低沸点组分时，SL模式更优。

图3 (a)PTV溶剂分流(SS)和(b)PTV不分流(SL)进样方式对PAHs峰强、峰宽的影响Fig.3 Effect of intensity and width of PAHs by (a) PTV solvent split and (b) PTV splitless modes

表1 溶剂分流和不分流进样模式下PAHs单体碳同位素的分析精度Table 1 Analysis precision of δ13C of PAHs by PTV solvent split and PTV splitless modes

2.2 PTV进样口参数的优化

PTV进样口的压力梯度、传输温度和时间、蒸发时间、不分流时间等均可能影响样品的传输效率，造成色谱目标物峰强度改变，甚至带来同位素分馏。压力梯度、蒸发温度和不分流时间等参数对溶剂和目标物(尤其低沸点)组分的分离度可能也产生影响(图2)。

2.2.1进样口压力

PTV进样口可以实现压力梯度变化。当初始压力为30psi、蒸发压力40psi时，16种PAHs的峰强度均远低于初始压力40psi、蒸发压力60psi时的峰强度，尤其沸点较低的萘基本无法检出。这可能是由于初始/蒸发压力小，载气流速慢，溶剂在蒸发时间段更少被传输至色谱柱，溶剂与目标物传输过程分离程度低导致目标物聚焦程度降低、峰强降低。当初始压力为40psi、蒸发压力60psi时，传输压力提高(70、80、90psi)对目标物的峰强度普遍产生负面影响。可能是由于传输压力过大导致样品蒸气堆积在色谱柱头以致倒灌，部分从Purge气路排出。初始压力40psi、蒸发压力60psi、传输压力70psi时大多数PAHs峰强度最高(图4a)。

2.2.2传输温度和时间

样品传输温度过低不能保证样品完全汽化，可能造成高沸点组分损失。对比传输温度280℃、300℃和320℃，结果显示传输温度达到320℃时二苯并(a,h)蒽和苯并(g,h,i)苝可以检出。传输温度升高能够提高目标物(尤其高沸点组分)的峰强，这与传统分流/不分流进样口温度提高效果类似。

传输时间过长可能会增强溶剂效应，时间过短目标物组分可能无法完全传输至色谱柱头，造成谱峰强度降低、碳同位素分馏。对比16种PAHs在不同传输时间(0.5min、0.8min、1.0min和1.5min)的峰强度(图4b)。沸点较低的8种PAHs(萘～芘)在传输时间为1.0min时峰强度最高，单体碳同位素分析结果最稳定(两次分析结果差值△δ13C在0.36‰以内)，萘和苊烯的峰宽展宽约14%～18%，但单体碳同位素分析结果未受影响；传输时间1.5min时沸点较低的8种PAHs谱峰强度略降低，单体碳同位素分析稳定性明显降低(△δ13C分布在0.2‰～-1.36‰之间)，这可能是传输时间增加，带来更多干扰物，基线抬升、共流出等造成碳同位素分析稳定性下降。沸点较高的8种PAHs[苯并(a)蒽～苯并(g,h,i)苝]的峰强度在传输时间1.5min和1.0min时相差不大；苯并(a)芘的两次单体碳同位素分析结果差值在传输时间1.5min时(△δ13C=-0.41‰)优于1.0min时(△δ13C=-0.83‰)，但均在仪器分析误差之内。期望在一个分析流程中获得16种PAHs的单体碳同位素比值或更关注低沸点PAHs组分时选择传输时间1.0min更优。

2.2.3蒸发温度和时间

PTV不分流模式中溶剂和溶质的传输过程不能通过物理阀门控制分开，挥发性较强的组分可能部分与溶剂同时汽化、传输，相对较难在色谱柱头聚焦。调整蒸发温度和时间，可以更好地将溶剂和目标物的传输过程分开。

不同蒸发温度(40℃、45℃、50℃、55℃)下，PAHs峰强度普遍在55℃时最高，仅沸点最低的萘在40℃时峰强最高(图4c)。不受溶剂蒸发影响的组分，使用较慢温度梯度或增加一定时间的恒温能够更好地控制传输过程，有利于溶剂和目标物传输过程分开[44]。针对PAHs沸程较宽的环境样品时选择55℃蒸发温度。

对比不同蒸发恒温时长(1.5、2.0、2.5、3.0min)，沸点高于苯并(k)荧蒽的组分在蒸发时长2.5min时峰强度最高，1.5min时略低；其他PAHs的谱峰强度普遍在1.5min时最大，2.5min次之(图4d)。PAHs单体碳同位素分析精度在蒸发时长2.5min时，分析精度最优(SD<0.45‰，n=3)，其他蒸发时长(1.5、2.0、3.0min)下分析精度分别为0.55‰、0.53‰和0.67‰(n=3)。针对16种PAHs单体碳同位素分析选择蒸发时长2.5min更优。

图4 PTV进样口参数对PAHs峰强度的影响Fig.4 Effect of PTV injector parameters on intensity of PAHs

2.2.4进样口不分流时间

不分流时间以进样口达到传输温度为始、分流阀打开为止，时间过长溶剂效应会增强，时间过短可能样品不能全部传输至色谱柱而引起同位素分馏。

2.3 毛细管预柱对色谱峰形的影响

不分流进样模式下，样品汽化后的体积相对于分析柱内载气流量太大，导致样品的初始谱带展宽，既不利于谱峰基线分离，还会降低峰强度。在进样口和色谱分析柱之间增加一段1～2m的无固定相涂层的毛细管预柱可以改善峰形。对比增加预柱前后，16种PAHs的谱峰拖尾得到改善，峰强度明显增加，尤其对高环PAHs这种作用十分显著，苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、二苯并(a,h)蒽和苯并(g,h,i)苝的峰强度提高了50%～100%(图5)。

各组分别为：1—萘；2—苊烯；3—苊；4—芴；5—菲；6—蒽；7—荧蒽；8—芘；9—苯并(a)蒽；10—；11—苯并(b)荧蒽；12—苯并(k)荧蒽；13—苯并(a)芘；14—茚并(1,2,3-cd)芘；15—二苯并(a,h)蒽；16—苯并(g,h,i)苝。图5 增加预柱前后PAHs色谱峰Fig.5 Effect of pre-column on peak shape of PAHs

2.4 分析精度和准确度

表2 优化后的分析方法对PAHs的单体碳同位素的分析精度Table 2 Precision of δ13C of PAHs by the optimized instrument method

a—对比GC-IRMS和EA-IRMS对5种PAHs单体碳同位素分析结果；b—GC-IRMS和EA-IRMS对5种PAHs单体碳同位素分析结果差值(△δ13CEA-GC)与PAHs沸点的关系。

3 结论

经过优化，PTV-GC-IRMS进样口最优参数为不分流进样、进样口压力40psi—60psi—70psi梯度升高、传输温度320℃、传输时间1.0min、蒸发温度55℃、蒸发时间2.5min、进样口不分流时间1.5min。进样口增加2m毛细管预柱能进一步改善色谱峰峰形，5环PAHs峰强度最高增强50%～100%，对16种PAHs的单体碳同位素比值分析精度(1σ)均在0.5‰以内，系统性碳同位素分馏可以采用双标法校正。

优化后的方法明显提高了PAHs的GC-IRMS色谱峰强度，可以实现低含量PAHs的高精度分析，通过正交实验可能实现方法的进一步优化。理论上优化后的PTV-GC-IRMS方法对低含量半挥发或不挥发有机样品(如农药残留等)同样适用，今后有必要采用多种类型的实际样品如土壤、大气沉降等验证该方法。