miRNA对糖尿病脑病的临床意义

胡菲菲 辛静昕 张新焕

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东济南 250117；2.山东第一医科大学第二附属医院内分泌科，山东泰安 271000

糖尿病是一种与中枢神经系统疾病风险增加相关的代谢疾病［1］。糖尿病脑病因其可导致神经系统的电生理、结构、神经化学和变性改变，严重损害神经功能而受到越来越多的关注［2］。并且，糖尿病脑病通常与痴呆症甚至阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD）的发病率有关［3］。患有2 型糖尿病的患者更容易出现轻微的认知障碍，并且与没有糖尿病的患者相比，认知能力下降速度加快，与非糖尿病人群相比，糖尿病患者患痴呆症的风险增加了1.5倍［4-5］。糖尿病记忆障碍的并发症始于轻度认知障碍（MCI），后期容易导致AD［6］。近年来，伴有轻中度认知障碍的糖尿病中枢神经系统并发症的发生率逐年增加［7］。因此提高糖尿病患者糖尿病脑病的早期筛查，对改善患者的预后及生活质量有非常重要的意义。

微小RNA（miRNA）是一种小的内源性非编码RNA 分子，大约由21～ 25 个核苷酸组成。它们作为一类基因表达调节剂，在转录后水平发挥作用，并微调蛋白质编码基因的表达。有数据表明，微小核糖核酸非常稳定，不容易降解，能顺利进入血液，并长期滞留，发挥调控作用。小而保守的微小核糖核酸，作为治疗癌症、心血管疾病和糖尿病等复杂疾病的药理学靶点，引起了巨大的研究兴趣［8-9］。随着近年来患病率的增加，越来越多的研究表明血液中许多miRNA 在糖尿病脑病的发病过程中发挥了重要作用，使miRNA可以作为糖尿病脑病的潜在生物标志物和新治疗目标。

1 miRNA在糖尿病脑功能障碍中的诊断意义

1.1 miR-126

miR-126 是一种血管生成miR，主要在内皮细胞中表达［10］。miR-126是与糖尿病最一致的miR之一［11-12］。Zhang 等［13］研究发现，与正常人相比，易感个体和已确诊的2 型糖尿病（T2DM）患者的血浆miR-126水平明显降低，miR-126水平与糖尿病的发展呈负相关。Venkat 等［14］在试验中测量了非糖尿病对照组和非糖尿病脑卒中组以及T2DM对照组和T2DM 卒中组小鼠血清miR-126 的表达。结果显示，T2DM 和脑卒中都显著降低了miR-126 的表达，在T2DM脑卒中小鼠中观察到的降低程度最大。通过以上研究，可以发现糖尿病及脑卒中可以分别降低miR-126 的表达，因此循环中的miR-126 可作为早期识别T2DM易感个体和脑卒中患者的潜在生物标志物。

1.2 miR-146a

研究表明，T2DM 患者的血清miR-146a 水平显著降低［15-16］。Duan 等［17］的试验结果显示，糖尿病和缺血性卒中患者和仅糖尿病患者血小板及血浆miR-146a 的表达显著低于健康对照组。在仅缺血性卒中患者和健康对照组之间，血小板及血浆miR-146a 的表达没有差异。Bhaumik 等［18-19］已经发现miR-146a 抑制IRAK1 和TRAF6 的表达，并通过NFκB进一步激活TLR信号通路，从而刺激血小板释放促炎因子，随后加速血管炎症反应和血管重塑，从而在动脉粥样硬化和缺血性中风的发展中发挥关键作用。

因此，可以推测高血糖通过下调糖尿病患者的miR-146a表达导致IRAK1和TRAF6表达的上调，从而促进血小板活化和动脉血栓形成，同时增加缺血性卒中的风险。因此，可以通过监测患者的miR-146a 水平来预防糖尿病的发生及降低缺血性卒中的风险。

1.3 miR-223

Duan等［17］研究发现，缺血性脑卒中和糖尿病或仅糖尿病患者的血小板和血浆miR-223表达显著下调，而缺血性脑卒中患者仅与健康对照组相比无显著下调。且进一步观察到miR-223表达的缺失导致血小板P2Y 12 受体表达上调，从而拮抗IRS-1 的调节作用，进而导致血小板活化、动脉血栓形成以及缺血性脑卒中风险的增加。高血糖可能下调糖尿病患者的miR-223的表达，导致血小板活化，从而增加缺血性脑卒中的风险。

1.4 miR-144

Yang 等［20］通过研究发现，与高血压患者相比，T2DM患者观察到明显的血小板活化。在糖尿病合并急性缺血性脑卒中患者中表现出更明显的血小板活化。血小板活化与血小板中p2y 12 表达的升高和IRS-1 表达的减少、IRS-1 酪氨酸磷酸化、PI3K酪氨酸磷酸化和Akt 丝氨酸/苏氨酸磷酸化有关。血小板中p2y 12表达的升高和IRS-1表达的降低与糖尿病患者血浆和血小板中低水平的miR-223和高水平的miR-144相关，而与白细胞无关。因此，血小板和血浆miR-223 的低表达以及血小板和血浆miR-144 的高表达是T2DM 患者缺血性脑卒中的危险因素。

1.5 miR-132

miR-132 广泛分布于大脑中，在调节神经元分化、成熟和功能方面发挥作用，此外，它还参与轴突生长、神经迁移和可塑性［21］。

Fatimy等［22］认为miR-132是神经元健康的主要调节因子，补充miR-132 对治疗Tau 相关的神经退行性疾病具有益处。证明miR-132 保护原代小鼠和人类野生型神经元和更脆弱的Tau 突变神经元免受Aβ 和谷氨酸兴奋毒性。Bekris 等［23］对转基因小鼠进行的一项研究显示，海马miR-132 略有过度表达，空间学习能力增强。而miR-132 过度表达超过3 倍会损害学习。Hansen 等［24］发现，认知能力受到miR-132 的严格调节，miR-132 的生理水平增强认知，而miR-132 超生理水平会导致认知缺陷。此外，miR-132 的过度表达（3 倍）会导致严重的认知障碍。Salama 等［25］研究表明，T2DM 轻度认知障碍患者血浆中miR-132 的表达显著高于无轻度认知障碍患者和正常认知健康人（中位数分别为2、1.1和1.2，P＜0.05）。miR-132 是唯一一种显著区分T2DM 轻度认知障碍患者和正常认知障碍患者的miR 基因，敏感性为72.3%，特异性为56.2%，准确性为63.8%（P＜0.05）。

以上研究表明，miR-132作为神经元调节因子，必须保持在一定的生理水平，以确保正常的学习和记忆形成，并且可以作为区分T2DM 轻度认知障碍患者和正常认知障碍患者的生物标志物，为糖尿病脑病的早期筛查提供重要依据。

1.6 miR-503

Sheikhbahaei 等［26］设计了一项横断面研究，评估和比较miR-503在糖尿病缺血性脑卒中的急性和慢性期的表达。在急性期，糖尿病缺血性卒中患者中miR-503的平均表达水平显著高于非糖尿病脑卒中患者、仅糖尿病患者和健康对照组（P＜0.05）。另一方面，与对照组相比，非糖尿病卒中患者和仅糖尿病患者的miR-503 表达水平差异无统计学意义。在慢性期，miR-503 的平均相对表达在各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。虽然较高的miR与急性期更多的残疾有关，但它不影响缺血性脑卒中患者的长期预后。这项研究表明高血糖和缺血情况共同导致miR-503 水平急剧升高，但在3 个月后降至正常范围。由于miR-503 在血液中足够稳定，它可以用作糖尿病患者缺血性脑卒中急性期的潜在诊断标志物，其水平也是脑卒中严重程度和患者短期预后的指标。

1.7 miR-368

孟开顺等［27］通过实验发现，miR-368 在糖尿病脑病患者外周血血清和单核细胞中的表达水平明显上调，si-miRNA-368干预后糖尿病脑病患者外周血单核细胞增殖受到抑制，凋亡率增高。研究结果表明，miR-368 抑制单核细胞的凋亡，从而促进了糖尿病脑病的发生发展。因此，miR-368 可以作为糖尿病脑病早期诊断的生物学标志物，但仍需大样本的临床调查以评价其对糖尿病脑病的诊断价值。

2 miRNA在糖尿病脑病中的治疗价值

2.1 miR-146a

Kalani 等［28］在研究中使用肥胖T2D db/db 小鼠模拟T2DM 病人的病理，应用不同行为测试的研究表明，与非糖尿病db/m 对照组相比，12～ 14 周龄T2D db/db 小鼠表现出异常的探索行为和短期记忆丧失。通过Western blot 检测发现，与db/m 对照组相比，T2D db/db小鼠大脑中细胞朊病毒蛋白（PrPc）表达增加。最近的研究已经确定PrPc 可以在复合沉积中发挥重要作用，因此，它可以作为治疗认知障碍的主要靶点［29-30］。Kalani等［28］还在研究中使用目标扫描进行的生物信息学分析显示，只有miR-146a 序列能够识别PrPc 的保守序列87～93 bp；还发现使用miR-146a负载的外泌体（BECDEs）治疗可降低PrPc 上调并对T2D db/db 小鼠的短期记忆功能有改善，但这并不显著，进一步的研究需要增加样本量。

研究表明，骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）可以通过分泌外来体改善糖尿病诱导的认知障碍［31］。Kubota 等［32］通过试验表明，在糖尿病链脲佐菌素（STZ）大鼠中，与在常规笼子（STZ/CC）中饲养的STZ 大鼠相比，在丰富的环境（STZ/EE）中饲养的大鼠，认知障碍显著减少，并且海马中的神经元和星形胶质细胞损伤减轻。与非糖尿病大鼠相比，STZ/CC大鼠BM-MSCs培养条件培养基和血清中外体中miR-146a 水平降低，而STZ/EE 大鼠中miR-146a 水平恢复。miR-146a 表达增加对糖尿病大鼠星形胶质细胞有抗炎作用。这些结果表明，丰富的环境刺激包括主动交流、减压和锻炼，通过刺激内源性BMMSCs 上调外体miR-146a 的分泌，从而对受损的星形胶质细胞发挥抗炎作用，并防止糖尿病引起的认知障碍。

以上两个研究从不同的方面证明了miR-146a在防治糖尿病脑病中的重要作用。

2.2 miR-219

海马是短期记忆回路的主要结构，在从短期记忆向长期记忆的转变中起重要作用［33］。糖尿病认知功能障碍的最重要原因是其可导致海马损伤［34］。miR-219 是一种脑特异性微小核糖核酸，其失调已在神经发育障碍如精神分裂症中观察到［35］。miR-219 在胎儿海马中大量表达，可调节大脑的衰老。NMDAR信号通路与丝裂原活化蛋白激酶超家族相同，通过神经元细胞的兴奋性信号转导参与T2DM 小鼠的LTP 抑制和海马神经元细胞的凋亡［36］。还发现miR-219 与NMDAR 信号有关，可影响信号传递和途径基因的表达［37］。

Zhang 等［38］研究发现，上调miR-219 可增加小鼠海马组织的LTP 和锥体神经元密度，降低db/db小鼠的血糖。此外，miR-219的上调抑制Bax、半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3蛋白的阳性表达，导致海马神经元细胞凋亡的抑制。该研究结果表明，miR-219 的上调通过下调NMDAR 信号通路降低了T2DM 小鼠的LTP 抑制和海马神经元细胞凋亡，因此表明miR-219可能是糖尿病脑功能障碍未来的治疗策略。

2.3 miR-126

miR-126 是内皮细胞中最丰富的miRNAs 之一，在调节内皮细胞功能、血管生成和血管完整性方面起着至关重要的作用［39-40］。Chend 等［41］研究发现，T2DM 显著降低了T2DM 小鼠血清和脑组织miR-126 的表达，增加了脑出血转化和血脑屏障渗漏，并降低了紧密连接蛋白的表达。并且首次证明延迟人脐带血细胞（HUCBC）治疗2 型糖尿病小鼠脑卒中可增加血清、脑组织和脑上皮细胞miR-126的表达，增加M2巨噬细胞极化，但显著降低缺血脑卒中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达。M2 巨噬细胞可产生抗炎细胞因子并且能够起到促进轴突的髓鞘形成和神经元的保护作用。MCP-1 的分泌促进单核细胞的浸润，从而引发炎症。因此HUCBC 治疗T2DM 小鼠脑卒中显著减少血脑屏障渗漏、脑出血，增加紧密连接蛋白表达，促进血管和白质重塑，具有抗神经炎症和改善卒中后的功能。抑制HUCBC 中miR-126 的表达显著降低了这些有益作用。

Venkat等［14］在研究中发现T2DM脑卒中小鼠与非糖尿病脑卒中小鼠相比，血清和脑miR-126 水平降低。内皮细胞外基质（EC-Exo）含有高水平的miR-126，并且EC-Exo 对T2DM 脑卒中小鼠的治疗显著增加了血清和脑miR-126 的表达，改善了神经功能和认知结果，增加了血管密度和动脉直径，增强了IBZ的轴突和髓鞘密度，并且诱导了M2巨噬细胞极化。抑制EC-Exo 中的miR-126 可减弱EC-Exo治疗诱导的T2DM中风小鼠的神经恢复作用。

以上研究可以发现，miR-126 在内皮细胞诱导的T2DM 脑卒中小鼠的神经恢复中起着重要作用，可以作为未来糖尿病脑病的治疗靶点。

2.4 miR-384-5p

研究已经证明了活化和浸润的巨噬细胞在慢性中枢神经系统神经退行性变进展中的作用［42］。研究发现炎性巨噬细胞的消除减轻了糖尿病脑病的进展和严重程度，而不影响小鼠血糖、血清胰岛素、葡萄糖反应和β细胞质量［43］。Wang等［44］发现脑巨噬细胞中自噬活性的改变似乎不是由自噬相关因子ATG7、p62的变化引起的，而是由Beklin-1的增加引起的。然而，Beklin-1 水平的增加不是由于基因转录的增强，而是由于抑制了Beklin-1 抑制性微小核糖核酸miR-384-5p。miR-384-5p 是一种靶向控制动脉粥样硬化发展中巨噬细胞自噬调控蛋白Beclin-1 的miRNA。因此，这些数据表明炎症性巨噬细胞中miR-384-5p 的下调可能会增强巨噬细胞自噬，并导致糖尿病性脑病的发展，这可能通过在巨噬细胞中miR-384-5p 的重新表达而被抑制。这些数据表明巨噬细胞中miR-384-5p 的重新表达显著减少了脑中的炎性巨噬细胞，从而阻碍糖尿病性脑病的发展，但不会改变糖尿病状态。

2.5 miR-27a

最近的研究表明，糖尿病引起的氧化应激会导致脑血管并发症和认知障碍［45］。Nrf2 是细胞抗氧化系统的主要调节因子，可由一些微小核糖核酸调节。miR-27a 是氧化还原敏感的miRNA 之一，在Nrf2 的下调和Nrf2 驱动的抗氧化基因表达的调节中起直接作用。槲皮素（QC）作为一种直接抗氧化剂，清除自由基并螯合金属离子。此外，QC通过调节Nrf2-ARE 通路在抵抗氧化应激中间接发挥重要作用［46］。研究发现口服槲皮素共轭超顺磁性氧化铁纳米粒子（QCSPIONs）在30～50 nm范围内，与纯QC 相比，在改善糖尿病大鼠的记忆功能方面具有更好的疗效，并提出了一种有效的维持学习和记忆的联合疗法［47］。Ebrahimpour等［48］的试验结果表明，QCSPIONs 作为一种有效的联合疗法，可以降低miR-27a 的表达，进而增加Nrf2 的表达和相应的抗氧化基因，从而改善糖尿病大鼠的记忆功能障碍。因此，miR-27a 也可作为治疗糖尿病脑病的研究靶点之一。

2.6 miR-29b

糖尿病是与AD 相关的主要危险因素之一。AD的主要特征是Aβ斑块积聚，其中涉及的主要酶是BACE-1［49］。因此，BACE-1 是AD 的主要治疗靶点。研究发现高葡萄糖和BACE-1表达增加之间的相关性导致Aβ 水平的增加［50］。此外，据报道miR-29b的缺失增加了BACE-1的表达［51-52］。Jash等［53］在体外和体内糖尿病模型中发现高血糖导致miR-29b下调。经人类miR-29b 治疗后，糖尿病小鼠的短期和空间记忆有显著改善。此外，人类miR-29b 治疗降低了糖尿病患者的氧化应激和BACE-1活性。目前的研究表明，高血糖可导致miR-29b 下调，而miR-29b 作为BACE-1 的直接靶标通过降低糖尿病小鼠的BACE-1活性来减轻记忆障碍，因此miR-29b在糖尿病脑病中具有重要的治疗意义。

2.7 miR-133a

内皮功能障碍在2型糖尿病血管并发症的早期发展中起着重要作用［54］。由一氧化氮（NO）损失引起的内皮功能障碍是心血管疾病的早期标志。偶联的内皮一氧化氮合酶必须完全被四氢生物蝶呤（BH4）饱和才能产生NO。GTP 环水解酶1（GTPCH1）作为内源性BH4 生物合成的限速酶，其在一氧化氮合酶功能中的重要作用已被充分证实。Yin 等［55］通过研究发现，在注射链脲佐菌素的大鼠中，高血糖显著诱导血管内皮miR-133a 异位表达，降低GTPCH1 基因表达和BH4 水平，从而引起内皮功能障碍，而小檗碱给药［1.0 g/（kg·d），8周］逆转了这一现象。另外在试验中通过测量主成分分析的血流灌注，表明长期高血糖引起的脑低灌注是血管认知障碍的主要原因。结果表明，小檗碱通过对miR-133a 的抑制提高了糖尿病大鼠GTPCH1 基因表达和内源性BH4 的水平，从而恢复高血糖引起的血流量减少，提高糖尿病大鼠的学习记忆能力。因此可以推测抑制高血糖诱导的miR-133a 异位表达可以成为糖尿病脑病的治疗方向。

2.8 miR-Let7A

完整的血脑屏障（blood brain barrier，BBB）对于维持大脑的微环境是必要的，BBB的破坏与各种疾病的发生有关，包括脑卒中、痴呆和癫痫［56-57］。脑内皮细胞作为BBB的主要成分，通过紧密连接蛋白如闭合蛋白和闭合蛋白之间的相互作用连接在一起［58］。糖尿病患者大脑中高血糖诱导的应激会引发BBB的破坏，导致包括脑卒中和痴呆症在内的多种神经疾病。Song 等［59］在研究中观察到在高糖条件下大脑内皮细胞中miR-Let7A 的表达下调，miRLet7A的过表达显著防止了高葡萄糖条件下bEnd.3细胞的细胞死亡和紧密连接蛋白的丢失，并减弱了前炎症反应和亚硝酸盐的产生。以上研究表明，miR-Let7A 可以通过控制细胞死亡信号、紧密连接蛋白的丢失和对高糖应激的促炎反应来减轻脑内皮细胞损伤和BBB 的破坏。因此推测可以通过上调miR-Let7A的表达来预防因BBB破坏引起的糖尿病脑病的发生。

2.9 miR-23b-3p

研究表明氧化应激参与糖尿病诱导的神经元损伤［60］。Han 等［61］通过研究发现高糖处理后，miR-23b-3p 的过度表达增加了神经细胞的氧化应激和凋亡。miR-23b-3p 的过度表达也抑制了神经细胞中SIRT1和Nrf2的表达。SIRT1已被证实通过调节一些关键酶的转录活性来发挥抗氧化作用［62］。SIRT1可保护胰岛β细胞，调节胰岛素释放，改善胰岛素抵抗，减轻炎症反应，调节脂质代谢［63］。因此，它可以参与调节葡萄糖体内平衡，从而抑制糖尿病和糖尿病诱导的器官功能障碍［64］。Nrf2 是细胞调节抗氧化应激反应最重要的转录因子［65］。研究结果表明，Sirt1/Nrf2信号通路参与氧化应激诱导的细胞凋亡，并通过miR-23b-3p引起糖尿病大鼠的认知障碍。因此抑制miR-23b-3p 的过度表达或增强Sirt1/Nrf2 信号通路活性可能是糖尿病脑病的潜在治疗策略。

2.10 miR-221

Sun等［66］在研究中发现，miR-221在糖尿病小鼠中高表达，而lincRNA p21和低聚果糖（FOS）低表达。miR-221，一种人类脂肪miR，据报道在肥胖人群中上调，对胰岛素抵抗产生影响［67-68］。此外，还发现miR-221 可以调节细胞凋亡和神经元的炎症反应［69］。FOS基因，也称为c-FOS，被认为是神经元活性的标志，是神经元存活和生长所必需的，具有神经保护作用［70-71］。FOS已被证明是microRNA-221的直接靶基因［72］。因此推测miR-221 可能通过调节FOS 的表达参与糖尿病诱导的海马神经元凋亡。LincRNA p21 被认为是细胞增殖、凋亡和DNA 损伤反应方面的一种新的控制因子，它是多种人类疾病的病理生理学和发展的基础［73-76］。Sun 等［66］在研究中还发现，糖尿病小鼠miR-221沉默或lincRNA p21过表达降低了Bax 和裂解半胱天冬酶-3 的表达，而增加了Bcl-2 的表达，降低了细胞凋亡率。研究发现，lincRNA p21 通过竞争性结合miR-221 来促进FOS 的表达，从而抑制海马神经元的凋亡。因此，lincRNA p21/miR-221/FOS可能作为治疗靶点，为糖尿病脑病的治疗提供有效的治疗策略。

2.11 miR-155

miR-155是miRNAs家族中的一员，新近研究发现，脑缺血性损伤以及在多种脑损伤同时存在的情况下，miR-155表达呈现显著变化［77-78］。韩江全等［79］的研究结果显示，糖尿病脑缺血大鼠的miR-155 表达较单纯脑缺血组明显上调，CD31和VEGF的表达较单纯脑缺血组明显减弱，而且神经功能评分明显增加、梗死面积也显著增大。CD31作为反应组织中微血管密度的特异性标志物，在脑缺血梗死周围区表达增加［80］。VEGF作为反映血管再生的标志性指标在缺血性脑组织中表达增加，并与CD31表达呈正相关，对缺血性脑组织具有保护作用［81］。并且还通过试验证明，miR-155 抑制物可显著减少脑缺血大鼠的miR-155表达水平，而CD31和VEGF 的表达显著增强，且可显著改善糖尿病脑缺血大鼠的神经功能缺损评分，减少脑梗死体积。韩江全等［79］的试验证实了miR-155在糖尿病加重脑缺血损伤中起着重要的作用，抑制miR-155 的表达可减轻糖尿病对脑缺血损伤血管再生的抑制作用，从而有利于脑功能恢复。

3 总结

综上所述，随着人口老龄化加剧和生活方式的改变，糖尿病和MCI的患病率在世界范围内不断增加［82］。研究发现，在36.2%的T2DM 患者中检测到MCI［83］。因此，早期识别及防治糖尿病及其并发症具有重要的社会意义。

miRNA 作为可以在体内稳定存在的非编码小RNA分子，越来越多地被用来研究其在各种疾病的早期筛查及治疗方面的作用。大量研究表明，糖尿病可导致体内多种miRNA 失调。糖尿病脑病也可导致几种miRNA 特异性地失调，并且不同的miRNA 可以通过不同的作用机制对糖尿病脑病起到治疗作用。总之，miRNA不仅是早期诊断糖尿病脑病的临床生物标志物，也是早期干预和治疗糖尿病脑病的潜在药物靶点。但仍需大量的临床试验验证miRNA 对糖尿病脑病诊疗的特异性及临床价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突