微小RNA调控增生性玻璃体视网膜病变的研究进展

杨俊楠，包秀丽

0引言

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的基本病理改变是在玻璃体腔和(或)视网膜表面形成由细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和各种类型细胞组成的视网膜前膜(epiretinal membranes, ERM)，ERM收缩形成视网膜皱褶，并牵拉视网膜引起视网膜脱离(retinal detachment, RD)。PVR的病理过程包括血-视网膜屏障的破坏、细胞的增殖迁移、增殖膜的形成与收缩、ECM的沉积和视网膜皱褶的形成5个主要阶段[1]。其中，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是PVR病理机制中的核心环节，在细胞因子/生长因子、转录因子及miRNA等的调控下，RPE细胞经历表型转化而转变为成纤维细胞样细胞并分泌ECM等成分，形成ERM。目前手术仍是PVR的主要治疗手段，但存在复发率高、预后视力差等问题，主要原因在于未从根本上抑制ERM的形成，且至今未找到可靠的防治方法。因此，探讨RPE细胞在EMT过程中的具体基质和调控因素尤为重要。近年来,越来越多的研究发现微小RNA(microRNA,miRNA)在许多疾病的稳态和发病机制中发挥着重要作用。本文对miRNA在PVR的病理机制，特别是miRNA调控RPE细胞EMT过程的研究做一综述，旨为PVR的防治提供更多的理论和实验依据。

1 PVR中的EMT

1.1PVR的发病机制PVR常见于RD或视网膜复位手术后，是导致RD复位手术失败的常见原因。PVR的形成是眼内组织的纤维化过程，当视网膜组织在缺血缺氧、氧化应激、代谢障碍和炎症等因素刺激下，血-视网膜外屏障受到破坏，异位的环境导致RPE细胞发生增殖和迁移，在玻璃体腔和(或)视网膜表面形成ERM，ERM收缩形成视网膜皱褶和RD[1]。此外，外层视网膜由于缺血发生视网膜感光细胞死亡和视网膜内纤维化，从而导致外层视网膜僵硬和功能丧失，最终造成不可逆的视力损害[2]。在PVR病理改变中，不同部位的视网膜纤维增殖膜的组织学结构各有差异：视网膜表面增殖膜中细胞占大部分的是转分化的RPE细胞，还包括富含α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle action, α-SMA )的肌成纤维细胞(Myofabroblast, Mfb)、富含胶质纤维酸性蛋白的神经胶质细胞和CD68阳性的巨噬细胞；视网膜下增殖膜中主要以CK17阳性的RPE细胞为主，间杂着Mfb、CD68阳性的巨噬细胞和Müller细胞等；视网膜内的增殖膜中以Müller细胞为主，其他细胞成分还有待研究[3]。由此可见，参与PVR的主要细胞类型有RPE细胞、成纤维细胞(主要来源于RPE细胞)、免疫细胞(主要是巨噬细胞、淋巴细胞)和神经胶质细胞(主要是Müller细胞)。其中，RPE细胞在PVR的EMT中发挥着关键作用[4]。在RD中，RPE细胞从Bruch膜上脱落下来通过视网膜裂孔游走到玻璃体腔、视网膜表面或是视网膜下空间，在相关因子作用下引发一连串的级联反应包括EMT、细胞迁移、趋化、侵袭以及ECM收缩等[5]。历经EMT的RPE细胞成为多能干细胞，失去上皮特性表现出间充质细胞特征，包括迁移、侵袭、抗凋亡和产生ECM的能力增强[6]。同时，RPE细胞还可转化为成纤维样细胞，产生α-SMA和胶质纤维酸性蛋白等物质并参与形成ERM。在EMT中，转分化的RPE细胞是一种最常见的EMT形态，被认为是PVR这一复杂纤维化过程的主要参与者。

1.2PVR中的RPE细胞RPE细胞是具有色素微绒毛的高度分化的单层细胞，生理状态下整齐排列在视网膜神经上皮层与脉络膜之间的Bruch膜上，该膜含有透明质酸、基质蛋白、硫酸软骨素、弹性蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ型胶原等[7]。RPE细胞是血-视网膜外屏障的组成部分之一，参与脉络膜毛细血管与视网膜光感受器细胞之间的物质转运，具有支持和营养光感受器细胞、再生及修复等功能。在生理条件下，RPE细胞处于分裂静止状态，不会进行增殖和迁移，停留在G0期。视网膜出现裂孔时，由于血-视网膜外屏障受损或异常活化的细胞分泌大量的细胞因子和生长因子释放入玻璃体腔[8]，暴露于玻璃体腔的RPE细胞失去上皮表型，转换为具有高度侵袭迁移能力的纺锤状的间充质细胞。在转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α)和凝血酶等因子的刺激下，静止的RPE细胞被激活进入活跃的细胞周期，具有更强的增殖、迁移和发生EMT的能力[9]。RPE细胞经历EMT过程转化为成纤维细胞样细胞，与神经胶质细胞等共同作用并分泌ECM形成ERM，引起RD。因此探讨RPE细胞在PVR中的分子机制，对PVR的早期防治具有重要意义。

1.3RPE细胞的EMT EMT是指上皮细胞在多种因素的作用下失去其上皮表型转化为间充质表型的生物学过程，EMT介导三种类型的生理功能：(1)促进胚胎和器官的发育；(2)加速创伤修复、组织再生和器官纤维化进程；(3)参与肿瘤的发生、转移和侵袭过程[10]。EMT是一个动态且可逆的过程，具体包括细胞表面分子的异常表达、细胞骨架的重建、顶-底极性的缺失、ECM的过度分泌、细胞增殖和迁移侵袭能力增强。EMT过程中的分子机制包括上皮细胞标记物包括紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)、P-钙黏蛋白(P-cadherin)、细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达降低，以及间充质标记物包括α-SMA、波形蛋白(vimentin)和纤连蛋白(fibronectin)的表达增加[11]。RPE细胞发生EMT转分化为Mfb的过程被称为上皮-肌成纤维细胞转化(Epithelial-myofibroblast transition, EmyT)[12]。RPE中的细胞间黏附可通过由黏着连接(Adherens junctions, AJs)、紧密连接(Tight junctions, TJs)和缝隙连接(Gap junctionss,GJs)组成的连接复合体维持，而紧密连接蛋白ZO-1和E-cadherin、P-cadherin和N-cadherin等是细胞间黏附作用的必要条件。α-SMA是一种参与调节细胞运动的细胞骨架微丝蛋白，具有极强的收缩性能。Vimentin也是一种细胞骨架蛋白，在迁移过程中起着稳定细胞结构的作用。Fibronectin是一种细胞内微丝沉积所必需的间充质蛋白。最近的研究表明，细胞间黏附作用在维持RPE细胞上皮表型方面很重要，RPE细胞间这种连接的破坏可诱导EMT发生。Zhitnyak等[13]发现当RPE细胞发生E-cadherin到N-钙黏蛋白(N-cadherin)的“钙黏蛋白转换”，正常的细胞间黏附被破坏，最终导致RPE细胞发生EMT。

2 miRNA对EMT的调控

miRNA是一组由18～24个核苷酸组成的内源性非编码单链小RNA，序列具有高度保守性，充当信使RNAs(mRNAs)的转录后调节剂，可与目的mRNA的3’-非翻译区(3’UTR)特异性结合，通过对靶基因表达和蛋白质翻译的负反馈调节来调控机体的基本生物过程，例如细胞增殖、侵袭迁移、分化、凋亡和EMT等过程[14]。单个miRNA可以同时下调多个靶点，这些靶点通常属于同一代谢或信号通路，提示miRNA在调节细胞活动中的重要性。目前已知眼部存在百余种miRNA，差异性地表达于角膜、晶状体、视网膜、RPE和脉络膜组织中，参与调控多种生理和病理的生物学活动，特别是miRNA与RPE细胞的EMT过程密切相关[15]。可知，miRNA是调控EMT的重要表观遗传因素之一。因此，明确miRNA调控RPE细胞EMT过程的作用机制对于纤维化疾病(例如PVR)的防治具有重要意义。

3 RPE细胞中的miRNA和EMT

近年来，越来越多聚焦于miRNA的研究发现其与心脏、肺、肾和肝脏等器官纤维化过程有着密不可分的关系，是纤维化疾病的有效调节剂。在眼部，若干特定的miRNA可直接靶向调节多种EMT相关转录因子，进而诱导或抑制RPE细胞的EMT过程，在PVR的病理进程中发挥关键作用。

3.1miR-124 miR-124主要在哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system, CNS)中呈高表达状态，是CNS发育的关键调节因子之一[16]。研究发现miR-124通过靶向前列腺癌细胞中的Slug基因抑制TGF-α 诱导的EMT，miR-124也可调节乳腺癌MDA-MB-231细胞中的Slug基因来抑制EMT过程[17-18]。视网膜神经节细胞与CNS组织均起源于神经外胚层，miR-124在视网膜中也呈现高表达状态。Jun等[19]发现miR-124在RPE细胞通过靶向结合RHOG 3’UTR区域以抑制EMT中的细胞迁移，从而阻碍PVR的发生。具体机制为TGF-β1的作用下，过表达的miR-124与RHOG 3’UTR区域相结合，下调RHOG的表达，RHOG既是控制肌动蛋白重塑的关键信号分子又可以作用于其下游的RAC1，调节TGF-β1诱导的上皮细胞可塑性，从而抑制EMT发生[20]。转分化的RPE细胞能够分泌不同类型的胶原和纤连蛋白参与形成ERM，并在细胞因子的作用下影响细胞间黏附和细胞表型。研究发现，过表达的miR-124可以抑制胶原收缩、减弱细胞运动和增强细胞间黏附，抑制TGF-β1介导的ERM形成[7]。由此可见，miR-124通过TGF-β1/RHOG/RAC1途径参与了EMT过程，从而推测上调或加入外源性miR-124也许能够抑制PVR的发展，有望成为PVR防治的新靶点。

3.2miR-29b miR-29b是miR-29家族的成员之一，通常在正常组织中呈现高表达，而在神经母细胞瘤、胶原母细胞瘤、慢性淋巴细胞白血病和肺癌等肿瘤组织中呈现低表达，并且与器官的纤维化高度相关[21]。在肺纤维化模型中发现，上调的miR-29b通过降低TGF-β1的表达水平，导致成纤维细胞和胶原蛋白生成减少，从而抑制肺纤维化中的EMT进程[22]。Li等[23]首先检测了TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT的miRNA表达谱，发现在5种表达下调的miRNAs中，miR-29b的下调最显著。

存在于人Mfb的miR-29b可通过调节PI3K、AKt和Sp1信号分子参与纤维化进程。在人RPE细胞中，上调的miR-29b可以特异性结合Akt2，作为非SMAD信号通路之一的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/ Akt途径的重要组成部分，在肺癌细胞、软骨肉瘤细胞和肾小管上皮细胞中介导细胞中的EMT。具体机制为TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT时，Akt2和p-Akt2表达上调，这一过程可被miR-29b阻断，提示miR-29b可能是通过阻断PI3K / Akt信号通路抑制PVR中的EMT过程[24]。此外，ARPE-19细胞中的miR-29b上调还可以直接抑制EMT过程，表现为α-SMA的表达下调以及E-cadherin和ZO-1的表达上调，从而抑制细胞的迁移[23]。这些结果证实了miR-29b及其靶基因Akt2在ARPE-19细胞EMT过程中发挥着重要作用，但其下游分子通路尚有待于进一步研究。

3.3miR-34a miR-34a在CNS中呈现高表达，通过结合下游靶基因调控细胞增殖、迁移及凋亡等过程[25]。miR-34a可通过与乳腺癌细胞中的肿瘤蛋白D52(TPD52)基因的3’UTR区域结合，抑制EMT过程中的细胞迁移和侵袭[26]。C-Met是一种肝细胞生长因子(HGF)受体，作为miR-34a重要的下游靶基因之一，参与调节细胞生长、迁移和再生过程。Hou等[27]发现miR-34a通过结合HGF/c-Met信号通路中的c-Met分子，下调c-Met基因的表达抑制RPE细胞增殖和迁移，减缓PVR的发展进程。Hou等[28]在之后的研究中发现LGR4也是miR-34a的下游靶基因之一，miR-34a与LGR4的3’UTR区域结合下调LGR4的表达，进而抑制ARPE-19的增殖、迁移和减弱细胞间黏附。miR-34a还可直接或间接调节细胞周期相关分子，包括E2F1、细胞周期蛋白依赖激酶2(Cyclin-dependent kinase 2, CDK2)、CDK4、CDK6和磷酸化CDC-2(p-CDC2)等，通过下调这些细胞周期调节因子进而阻断细胞由G1期进入S期，抑制PVR的发生[27]。可见，miR-34a通过下调其靶基因的表达，阻碍RPE细胞的增殖迁移，在PVR中发挥关键调控作用。以miR-34a和LGR4为基因靶点，在PVR的治疗中有着重要的临床意义。

3.4miR-let7c miR-let7c是miR let7家族的成员之一，通过负反馈调节多种器官纤维化中的EMT过程，在RPE细胞中可调控TGF-β2诱导的EMT过程[29]。在肾纤维化过程中，miR-let7c-5p直接与TGF-βmRNA 3’UTR的167-173位点结合，发挥对TGF-β的负反馈调控，影响肾脏的纤维化进程[30]。在TGF-β2诱导的PVR中，miR-let7c在RPE细胞中呈现低表达，诱导PVR的发生。当miR-let7c在RPE细胞中过表达时，通过作用于TGF-β2激活NF-κB信号通路，间充质标记蛋白N-cadherin和Vimentin的表达相对减少，上皮标记细胞角蛋白-18(Cytokeratin-18，CK-18)的表达相对增加，抑制EMT过程[31]。本研究中过表达的miR-let7c以NF-κB依赖性方式作为EMT过程的抑制因子，参与调控PVR的发生发展[31]，揭示miR-let7c可能成为PVR的防治的新靶点。

3.5miR-194 早期研究发现，miR-194在发育期小鼠的内耳膜和视网膜等器官感受器的上皮中表达。Lu等[32]的研究发现miR-194在视网膜各层组织中均有表达，在RPE-Bruch膜-脉络膜毛细血管复合体中表达最高，可以调节RPE细胞的功能。此外，在鼠的视网膜和人的ARPE-19细胞中富含miR-194，过表达miR-194的RPE细胞mRNA表达谱显示与感染、炎症、Hippo通路、NF-κB通路相关以及与RPE细胞吞噬作用、细胞间黏附以及与ECM相互作用等功能密切相关的基因呈现高表达。

体内和体外实验均发现，ARPE-19细胞中过表达的miR-194可通过7-mer区域与ZEB1的 3’UTR区域互补结合，激活TGF-β1/ZEB1及Hippo信号通路来负反馈调节ZEB1的表达水平，抑制TGF-β1诱导的α-SMA的表达[33]。ZEB1是调节细胞可塑性和激活EMT、诱导肿瘤发生和转移的重要驱动因子。同时发现，高水平的miR-194通过经典TGF-β1途径以及与SMAD3协同作用调节ZEB1下游靶标的表达，包括上调E-cadherin和ZO-1等上皮标记基因的表达，下调N-cadherin、fibronectin等间充质标记基因的表达[33]。可见，敲低RPE细胞中ZEB1的表达可减弱其与SMAD3之间的相互作用，能够有效抑制EMT过程。除通过与TGFβ-1和ZEB1的交互作用外，miR-194可以通过Hippo通路激活ZEB1的转录启动EMT，ZEB1通过抑制miR-200家族、miR-203、miR-183和miR-141的表达促进EMT、ZEB1可与其它EMT相关蛋白包括BMI1、EP300、IGFRIR和FOXM1之间互相调控，主要通过SNAI1和SNAI2与Hippo通路相联系[34]，ZEB1是不可或缺的核心成分。总之，miR-194过表达可抑制TGF-β1诱导的EMT过程，并降低ZEB1的mRNA和蛋白表达，这为PVR的防治提供了新的理论依据。

Chen等[35]研究发现，在经TGF-β2处理的ARPE-19细胞的EMT中185种miRNAs被下调，而119种miRNAs被上调，而且大多数miRNA通过影响与EMT相关的因子来间接参与PVR的发生，未来仍有许多未知的miRNA及其作用机制有待进一步研究。

4小结

综上，PVR是一个由多因素、多通路共同调控的疾病，RPE细胞通过EMT过程介导ERM的形成是PVR中的关键步骤。目前已有大量研究证实miRNA在PVR的EMT过程中的重要作用，但针对miRNA及其下游靶基因的作用机制尚不完全清楚，仍有待进一步研究。探索miRNA和miRNA激动剂/拮抗剂，或与其他抗PVR药物的联合应用，可以为防治PVR药物的研制和开发开辟新领域。