转录组测序技术在癫痫诊疗中的应用

2023-01-04张敬军

山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报 2022年1期

康慧张敬军

山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东泰安 271000

癫痫是一种高度异质性的慢性神经系统疾病，全世界约有5 000万癫痫患者［1］，癫痫发病机制尚未明确，2017年国际抗癫痫联盟（ILAE）将导致癫痫的病因分为六类：遗传性、代谢性、结构性、免疫性、感染性和病因未明等［2］。近年来，随着基因测序技术的发展，尤其是转录组测序（RNA-sequencing，RNAseq）技术广泛应用于医学研究，大量癫痫相关基因被发现，RNA-seq对癫痫的发病机制研究有重要价值，本文探讨RNA-seq在癫痫诊疗中的应用。

1 RNA-seq

RNA是以DNA一条链为模板，依照碱基互补配对原则，转录形成的一条单链，可引导蛋白质的合成，是连接DNA与蛋白质的桥梁。RAN种类繁多，目前在生物体内已发现10多种RNA，如信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、miRNA、小分子RNA（small RNA）、不均一核RNA（hn RNA）、端粒酶RNA等，其中mRNA、tRNA和rRNA是细胞质中参与蛋白质合成的三类主要的RNA［3］。转录组是特定组织或细胞在特定发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合，具有空间和时间特异性，反映细胞或组织在特定状态下的表型和功能，对细胞生物活性调节发挥重要作用［4］。转录组学是从RNA水平上研究基因表达，属于功能基因组学研究范畴。

RNA-seq又称转录组高通量测序，是转录组学发展的创新性技术，通过检测一个生物体中全部RNA的表达水平，从而获得基因表达。RNA-seq技术应用广泛，是后基因组时代对基因组结构和功能进行深入研究的首选技术，应用RNA-seq可获得物种或者组织的转录组信息，得到转录组上基因的相关信息，挖掘新的基因，优化基因结构，发现可变剪切及基因融合，分析基因表达差异等［5］。

RNA-seq目前主要应用在基因表达水平及差异分析。在神经精神系统疾病中，RNA-seq得到广泛应用，如癫痫、孤独症、精神分裂症、抑郁症等［6］。RNA-seq解决了传统测序技术面临的问题，相对于其他测序技术有明显的优势：①不依赖参考基因组，对于大多数没有高质量完成基因组的有机体，从头组装可以提供一组初始转录物，从而进行RNA序列表达研究［7］；②效率高，测序速度快，极大缩短了转录组的测序时间；③敏感度高，RNA-Seq已成功地用于分离基因组中相邻的重叠基因和相反的链［8］；④精确性高，对嵌套基因和多映射基因可做到精确量化［8］；⑤费用成本低，人类第一次基因组测序花费有几百万美元，而利用高通量测序的成本大大降低；⑥操作简便，无需提前针对已知序列设计探针，不需要克隆等过程，对样本量要求较少。

目前，RNA-Seq主要有3种测序平台：Roche/454、ABI/Solid、Illumina/Solexa，测序原理及序列长度的差异决定了这3种测序平台在不同领域的应用［9］。通常应用Roche/454平台探索单核苷酸多态性，应用ABI/Solid测序平台测序细胞转录组，应用Illumina/Solexa测序平台对哺乳动物转录组进行分析研究。

2 RNA-seq技术在癫痫中的应用

2.1 难治性癫痫

难治性癫痫约占癫痫患者的20%~30%［10］，难治性癫痫患者不仅死亡率显著增加，早期发病还伴随认知、行为、运动障碍和神经发育迟滞［11］。在儿童以Lennox-Gastaut综合征为代表，成人以难治性颞叶癫痫为代表，颞叶癫痫中约30%是药物难治性癫痫，手术是主要治疗方法之一，然而仍有1/3患者在术后继续出现癫痫发作［12］。海马硬化（hippocampalsclerosis，HS）是难治性颞叶癫痫中最为常见的神经病理类型，主要病理改变为抑制性神经元数目减少，神经元树突棘丧失及星形胶质细胞反应性增生，约70%的难治性颞叶癫痫患者在磁共振上显示出海马硬化迹象［13］。文献报道，与对照组相比，难治性颞叶癫痫患者海马中参与突触功能和离子通道的基因甲基化程度较高，不同亚型的海马硬化甲基化程度也不同，这反映在基因的差异表达中［14］。Griffin等［15］应用RNA-seq对伴有或不伴有海马硬化的颞叶癫痫患者的齿状颗粒细胞进行测序分析发现，与没有海马硬化的样本相比，海马硬化样本中55个转录物显著上调，11个转录物显著下调，这些差异基因主要与氧化磷酸化、神经变性和突触传递相关。在动物模型中应用RNA-seq分析癫痫持续状态诱导的海马RNA表达差异［16］。Dixit等［17］应用RNA-seq技术对难治性癫痫患者切除的海马组织进行转录组分析，发现难治性癫痫患者中56个显著调节基因，这些基因主要与神经免疫、神经炎症、能量代谢及突触传递等有关，为难治性癫痫的基因组学提供了新的认知。目前，难治性颞叶癫痫患者发病机制尚未阐明，Hammer等［18］对高频率癫痫发作和低频率癫痫发作患者的海马组织进行RNA-seq，并进行一系列差异表达和富集分析，发现与低频率癫痫发作组相比，高频率癫痫发作组与更多信号通路改变有关，其中很多信号通路失活。

2.2 Dravet综合征

Dravet综合征又称为婴儿严重肌阵挛性癫痫，于婴儿期出现症状性癫痫性脑病，癫痫发作表现为多种形式，包括局灶性发作、全面强直-阵挛发作、肌阵挛发作及非典型失神发作等，易出现癫痫持续状态，该病猝死率大约为10%［19-20］。研究显示约70%~80%的Dravet综合征由SCN1A突变导致［21］，是该病最常见的致病基因，该基因编码电压门控钠离子通道，突变诱发大脑神经元细胞功能障碍，从而导致癫痫发作。研究发现，海马硬化的儿童中71.4%为Dravet综合征，平均年龄为7.2岁［22］。Hawkins等［23］研究发现Dravet综合征小鼠模型，一组129S6/SVEVTAC（129）SCN1A+/-系小鼠具有正常表型和寿命，而另一组［129xc57bl/6j］f1-scn1a+/-系小鼠出现自发性癫痫以及高死亡率，利用RNA-seq对这两组小鼠的海马组织进行候选基因分析，显示Gabra2基因为高度优先级候选基因，并且通过表达分析和药理学方法将Gabra2基因鉴定为影响SCN1A+/-Dravet模型中小鼠存活的推定修饰基因。

2.3 SCN8A脑病

电压门控钠通道基因SCN8A位于12q13号染色体上，在兴奋性和抑制性神经元中表达［24］，在轴突起始段和Ranvier节点浓度较高，SCN8A基因突变增加钠通道亚单位Nav1.6的活性，主要见于癫痫性脑病患者，被称为SCN8A脑病，该脑病的突出特征为出生后18个月内出现癫痫发作，多见于4个月大的婴儿，合并症包括发育迟缓、严重智力障碍、多发性精神障碍及多发性精神分裂症等［25］。一些研究发现良性家族性震颤、阵发性舞蹈病中也存在SCN8A基因突变［26］，与发热有关的全身性强直性癫痫发作也与SCN8A基因突变有关［27］。通过TALEN靶向将SCN8A脑病的患者中鉴定的基因突变p.Asn1768 Asp（N1768D）引入小鼠基因组中，然后在SCN8A脑病小鼠模型中进行RNA-seq，结果显示仅在癫痫发作后的前脑中转录谱有差异，癫痫发作后50个转录本的丰度增加超过3倍，15个转录本减少超过3倍，升高的转录物包括抗惊厥神经肽基因、参与反应性星形胶质细胞增生基因及损伤神经元的基因［28］，为抗癫痫药物研究提供了新的靶点。

2.4 遗传性癫痫

文献报道遗传性癫痫患者约占40%，大多数由基因突变导致，这些基因突变主要导致离子通道功能障碍，例如钾离子通道、钠离子通道、钙离子通道和氯离子通道［29］，其中电压门控钠离子通道是迄今发现与遗传性癫痫最为密切的通道，该通道由α亚基和β亚基组成［30］。在遗传性癫痫家族患者中，具有相同钠离子通道基因突变的家庭成员的临床严重程度具有差异性，这表明其他基因改变了初级突变的作用，导致临床表现的差异性，可以把这些基因称作修饰基因。Scn2aq54转基因小鼠模型由于Scn2a突变而具有癫痫表型，该突变导致钠离子通道失活［31］，Scn2aq54小鼠癫痫表型的严重程度与遗传背景高度相关。研究人员绘制了两个基因座，即染色体11上的Moe1（癫痫修饰区）以及染色体19上的Moe2，这两个基因座与Scn2aq54表型的严重程度有关［32］。研究发现C57BL/6J系小鼠与SJL系小鼠杂交后出现新一代小鼠，新一代小鼠与C57BL/6J系上同源的Scn2aq54小鼠表现出迟发性癫痫发作和较高的生存率。应用RNA-seq在Moe1中进行候选基因分析，对两系小鼠脑组织RNA进行测序，显示出几种作用强的修饰基因，包括两个电压门控钙通道亚基Cacna1g和Cacnb1，以及富含脯氨酸和酸性氨基酸的碱性亮氨酸拉链转录因子HLF［33］。认识遗传修饰基因的分子基础有助于人类研究新型抗癫痫药物，为癫痫的精准化治疗提供新靶点。

2.5 局灶性脑皮质发育不良（focalcorticaldysplasia，FCD）

FCD是皮质发育畸形（malformations of cortical development，MCDs）的一类特殊亚型，首先由Taylor等［34］于1971年报道。FCD的病理特征是皮质分子层结构紊乱以及出现异常神经元细胞。2011年，ILAE根据FCD患者的影像学、病理学及电生理特性，将FCD系统分为三型，即FCDⅠ型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc），FCDⅡ型（Ⅱa、Ⅱb），FCDⅢ型（Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd）。研究表明FCD亚型可以根据DNA甲基化来区分，FCD中的甲基化测序显示基因体、基因间区和增强子受到差异甲基化的影响［35］。目前，国内外对于FCD导致癫痫发作的机制尚不明确，以往的研究主要是对致痫细胞的探讨，研究认为巨型神经细胞和未成熟细胞可能导致了癫痫发作［36］。近年来随着基因技术的发展，有关报道提出FCD存在某些特征性基因突变，FCDⅡ型通常发病年龄早、癫痫发作频率高且发作时间长［37］。用微阵列分析了Ⅱb型FCD患者的微RNA表达差异，发现有24个微RNA表达存在差异，其中19个微RNA表达上调，5个表达下调［38］。以FCDⅡ型患者脑组织及正常对照脑组织为研究对象，应用RNA-seq及基因差异表达分析，研究发现FCDⅡa及FCDⅡb共同差异表达基因464个，对这些基因进行功能聚类分析发现其主要与阳离子运输通道、P2嘌呤受体通路、血管形成等有关。FCDⅡa特异性表达基因536个，FCDⅡb特异性表达基因687个，同时对这些特异性表达基因进行聚类分析发现，FCDⅡa特异性表达基因主要与离子通道有关，FCDⅡb特异性表达基因主要与细胞周期及中枢神经系统发育有关，这些共同差异表达基因和特异性表达基因为癫痫的发病机理及治疗提供了新的研究方向。