量化成像流式细胞仪在免疫相关研究中的应用

周羽 陈路 四川大学华西第二医院西部妇幼医学研究院疾病基因转录剪切调控实验室/出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室 （四川成都 610041）

内容提要：量化成像流式细胞仪具有多参数、高分辨率成像、高灵敏度以及高通量特点。文章综述近年来量化成像流式细胞仪优势特点及其在免疫细胞、免疫表型、炎症及免疫相关药物研发方面的研究。

流式细胞仪主要应用于检测细胞、细菌和微小颗粒物质等。利用多参数测量，流式细胞仪对细胞标记物进行荧光信号检测和强弱测定，反映筛选细胞的比例或者细胞表面和内部物质分布及含量等信息。传统的流式细胞分析基于一定的细胞上样量，对细胞的分群结果及细胞比例展示的是比较宏观的结果。而对于极微量细胞甚至单个细胞的亚细胞定位及细胞中物质分布、形态及大小的分析所获取的信息量很少。因此流式细胞技术的发展关注精准性、操作性、检测参数量、纯度、通量、灵敏度、流式数据展示以及数据分析等方面。新一代的流式细胞仪如量化成像分析流式细胞仪（ImageStreamXMark Ⅱ）将流式细胞分析、荧光显微成像、图像数据获取及分析软件结合一体，可以对每个细胞进行形态、结构以及亚细胞定位荧光信号采集，最终将细胞信息进行量化成像分析。目前，该仪器已广泛应用于肿瘤、纳米材料、免疫、植物、微生物、药物研发、外泌体研究以及方法学方面的研究。

1.量化成像流式细胞仪介绍

ImageStreamX Mark II量化成像流式仪在传统流式细胞仪的液流系统上整合显微成像技术，可高效每秒分析数千个细胞。该仪器也是由液流系统、光学系统和检测系统三部分组成，最高可以升级配置7根激光器，同时检测12个通道并采集细胞图像。而该仪器的软件部分涉及仪器操作、数据获取和分析，可以对采集的每个细胞图像进行量化参数分析，量化参数结果可以用于后续统计学分析，保证了数据的重复性和可靠性。仪器操作方面，该仪器具有自动激光校准、自动上样、自动开关机和清洗功能，同时具备系统自检。

2.量化成像流式仪技术优势

2.1 获取细胞形态及定位信息

量化成像流式技术将荧光显微成像技术与流式细胞技术相结合，对细胞形态、细胞定位及荧光标记物进行量化分析。仪器的特点主要是采用极限层流技术最大程度抑制液流中细胞的翻转，同时仪器的检测系统是选用广泛用于宇宙航拍和基于时间延迟积分技术的CCD，保障了高速流动中细胞的高分辨率成像效果。此外，成像流式细胞仪还可以与共聚焦显微镜联用，通过观察活细胞中病毒结构、侵染和复制机制，研究病原微生物和宿主的免疫反应[1]。因此，流动中的每个细胞图像可以被快速捕捉，细胞的各种形态学参数及物质定位信息可被用于后续分析，丰富了细胞的形态学统计数据。

2.2 精准细胞分群

在细胞分群实验中，如果能够同时结合细胞表面特定标记物和细胞形态结构图像，细胞分群效果会更好。传统的流式分析中通常需要人工圈门，该方法具有重复性差、耗时长、依赖主观和经验判断等缺点。流式分选时圈定细胞群的界线通常是直接在流式散点图或者柱状图上界定分割线，缺乏对界限附近细胞准确的归属判断，而量化成像流式分析可以清晰直观地观察界限处细胞形态及细胞荧光学特征，有效地判断出圈门的界限，从而更准确地分选出目的细胞。在本文关注的免疫相关研究的免疫表型分析中，对免疫细胞分群圈门的操作中量化成像流式细胞分析技术具有明显的优势。此外，量化成像流式细胞技术在稀有细胞分析方面可以获得更多细胞形态结构方面的图像信息及其他量化参数数据，有助于稀有细胞功能的进一步研究。

2.3 搭建大数据平台

传统的流式细胞仪上样系统通常受到限制，需要手动将样本依次放上，而量化成像流式细胞仪具有96孔板全自动上样功能，同一批样本可以同时制样和上样，减少了上样操作的繁琐性，适合高通量筛选试验。

细胞表面和细胞内荧光信号都可以通过量化成像流式细胞技术检测。不仅在细胞检测数量上可以从几万到几十万个细胞，还可以精确到每个细胞结构及亚细胞荧光信号的监测，很大程度地提高了通过流式细胞技术获得数据的有效性和效率。

因此，结合多参数、高通量筛选系统和每秒几千个细胞的分析速度，通过量化成像流式细胞仪可以高效获取海量的细胞数据。并且采集的荧光和形态学参数量化分析数据具有客观统计意义，有助于医院和科研机构分析研究平台和大数据平台的搭建。最重要的是，平台的搭建有益于基础科研和临床相结合的研究，用于免疫类疾病及其他各类疾病发病机制的研究。

3.量化成像流式细胞仪在免疫相关研究中的应用

3.1 免疫细胞功能

人体中各种免疫细胞发挥着不同的作用，在抗原呈递细胞功能研究中，T细胞和抗原提呈细胞的免疫突触之间无法进行成像分析，而量化成像流式技术可以获取量化成像信息，从而对细胞功能进行准确的分析。Habtamu等[2]通过成像流式仪分析抗原诱导下T细胞-单核细胞偶联来研究结核患者的免疫调控作用。成像流式细胞技术还可以识别淋巴细胞中抗原相关结合蛋白定位信息来判断免疫细胞激活状态。此外，该技术也应用在单核细胞趋化、自然杀伤细胞功能障碍、淋巴细胞中物质定位和脾细胞渗透性等研究中[3-6]。因此，在免疫细胞功能研究中，量化成像流式细胞技术主要利用成像功能对细胞与细胞之间的相互作用进行图像信息采集和分析。

3.2 免疫表型分析

利用流式细胞仪对细胞进行分群实验中，结合前向角散射光、侧向角散射光和细胞标志物荧光特征参数，在相应的散点图中设置不同的门来区分出不同的细胞群。而基于成像流式细胞仪对白细胞亚群分析进行方法学研究，可以较准确地区分不同的亚群。在1型糖尿病发病机制的研究中，通过量化成像流式仪可以观察抗CD20药物治疗后细胞亚群分类及表达量[7]。Rao等[8]通过量化流式分析检测二肽基肽酶-IV和免疫表型，研究巨噬细胞中调节二肽基肽酶-IV表达途径，结果表明通过靶向调节二肽基肽酶-IV表达途径可能是减少二肽基肽酶-IV引起的炎症的新策略。

3.3 炎症反应

炎症的发生通常与免疫细胞的激活相关，而炎症小体在人体免疫反应和炎症发生过程中具有重要作用。凋亡相关斑点样蛋白与胞质传感器蛋白组装与炎症小体的形成相关，炎症小体的形成可以激活caspase-1，促进IL-1β/IL-18的释放。其中凋亡相关斑点样蛋白聚集浓缩后形成凋亡相关斑点复合物，用传统荧光显微镜分析该复合物是经典的评估炎症小体活化的指标。但该方法耗时较长且样本量少，开发灵敏快速的检测方法是提高炎症小体相关疾病临床评估能力的手段。Lage等[9]构建了一种基于成像流式细胞技术测量凋亡相关斑点样蛋白斑点成像方法，同时可以检测活化的caspase-1在凋亡相关斑点样蛋白多聚体中的分布。该方法已在多种免疫性疾病、炎症类疾病和阿尔茨海默症中都有广泛的应用。在对41例多发性硬化症患者的研究中发现尿酸钠晶体可以激活炎症小体[10]。Nagar等[11]在细胞群和单细胞水平对凋亡相关斑点样蛋白斑点和caspase-1活性进行定量检测，量化信息包括斑点频率、面积以及细胞分布等。

3.4 药物研发

量化成像流式仪可用于细胞的摄取、靶向定向运输以及细胞结合情况的药物治疗作用研究。在单抗药物研发中，研究人员需要评估克罗恩氏病和溃疡性结肠炎疾病中抗β7整合素单抗etrolizumab药物的安全性和有效性。通过细胞培养，结合量化成像流式仪进行功能性动态体外黏附实验，对药物诱导细胞分化、细胞毒性以及细胞因子分泌进行分析，有助于阐明药物阻滞作用和免疫学机制[12]。在口服药效研究中，Pocock等[13]结合成像流式细胞技术和紫外荧光光谱分析技术发现聚乙二醇状的颗粒状载体更容易穿透黏液层。在生物制药研究领域，Pekle等[14]开发了细胞系中成像流式分析技术检测重组重链和mRNA，可用于筛选高产量的克隆细胞系。在疫苗研发方面，Schetters等[15]通过成像流式细胞仪鉴定骨髓来源的树突状细胞的内吞能力，同时区分膜上荧光和胞内荧光来跟踪受体的内在化，发现小鼠DC-SIGN/CD209a可作为抗原呈递和适应性免疫的靶点。此外，量化成像流式细胞技术可以展现药物作用后细胞数量统计、细胞形态结构变化、细胞代谢、增殖及凋亡等信息，通过细胞形态学数据及流式数据统计将数据进行定量，从而应用于大规模药物筛选试验。

4.小结

与传统流式细胞分析仪相比，量化成像流式细胞仪具有高通量、数据量化、细胞成像等特点，已在免疫疾病及免疫相关的细胞学研究中应用较多。观察免疫细胞之间相互作用，分析细胞内相关蛋白含量及定位信息，可以作为免疫激活信号检测或者疾病诊断标志。目前，量化成像流式检测炎症小体技术在神经类疾病、免疫及炎症中应用广泛。而在免疫细胞功能研究、免疫表型分析及药物研发方面，量化成像流式细胞也起到了重要的作用。同时，仪器在细胞学功能研究中还包括细胞周期、微核计数、细胞形变和趋化等。

量化成像流式细胞术作为细胞学领域强有力的分析工具，已应用在药物研发过程中细胞动态观察及靶点筛选，对免疫疾病中细胞信号调节及代谢通路研究提供进一步的量化成像数据支持。

因此，科学研究中基于成像信息的流式分析技术的研究手段可用于解决复杂的科学问题和临床检测方法的技术开发。这将不仅限于免疫类疾病发病机制、检测技术以及治疗手段的研究，而同时可以开发该技术用于其他类疾病及多种交叉学科的应用。此外，该技术可以完善流式细胞分析分选平台设备功能应用，进一步促进医疗机构及科研平台细胞高通量分析及大数据采集平台的搭建。这有利于基于细胞成像的流式技术用于疾病的诊断和治疗学科研究方向的发展。